调节单克隆抗体组合物中的非岩藻糖基化物类的制作方法

本申请要求于2016年1月6日提交的美国申请号62/275,384的优先权，其内容通过引用以其整体结合到本文中。发明领域本发明一般地涉及蛋白质生物化学领域。更具体地，本发明涉及用于生物反应器中重组抗体-表达细胞的营养进料方案，其显著减少所表达的抗体的不期需的同种型，并且能够调节所表达的抗体的非岩藻糖基化物类的水平。发明背景各个出版物，包括专利、公布的申请、登录号、技术文章和学术文章在整个说明书中引用。每一这些引用的出版物对于所有目的通过引用以其整体结合到本文中。作为生物制品价格竞争与创新法案(thebiologicspricecompetitionandinnovationact,bpcia)的一部分，如果数据显示，除了别的以外，产品与已经批准的生物制品“高度相似”，生物药品(在活有机体中生产或从活有机体衍生的)可证明为“生物仿制药(biosimilar)”。生物仿制药产品应至少保留美国食品药品管理局(u.s.foodanddrugagency)所批准的生物制品的生物学功能和治疗功效。单克隆抗体(mabs)可用作治疗蛋白。基于所选择的氨基酸位点从细微到显著的化学修饰，纯化的单克隆抗体最经常以复杂的异质混合物存在。理解这些修饰的影响在生物
技术领域：
相当重要。单克隆抗体具有电荷异质性，这优化获得有利静电相互作用的平衡，并决定其结构、稳定性、结合亲合力、化学性质以及因此，其生物学活性。原料药(drugsubstance)和药品(drugproduct)的一致性连同最大化的贮藏期限对药物开发者和制造者至关重要。原料药和药品的短贮藏期限常常转化为制造者的制造挑战和高生产成本。细胞培养或发酵过程期间，抗体和蛋白可经历称为翻译后修饰的现象。这些修饰促成治疗蛋白中见到的几种形式的异质性。另外，存在制造期间发生的由过程期间给予的应激引起的异质性形式，例如尺寸和电荷，其可由于酶促过程或自发降解和修饰发生。mabs通过几个不同的机制经历化学修饰，包括氧化、脱酰胺、糖化、异构化和片段化，这导致形成不同的电荷变体和异质性。化学和酶促修饰例如脱酰胺和唾液酸化导致mabs上的净负电荷增加，并引起pi值降低，从而导致形成酸性变体。c-端赖氨酸切割导致丧失净正电荷，导致酸性变体形成。产生酸性变体的另一个机制为形成各种类型的共价加合物，例如糖化，其中在富含葡萄糖的培养基中制造期间或如果制剂中存在还原糖在储存期间，葡萄糖或乳糖可与赖氨酸或精氨酸残基的伯胺反应。碱性变体的形成可起因于存在一个或多个c-端赖氨酸或脯氨酸酰胺化、琥珀酰亚胺形成、氨基酸氧化或唾液酸去除，这引入额外的正电荷或去除负电荷；两种类型的修饰均引起pi值增加。尽管对在生产和配制期间有效的降解途径有大量知识和经验，当前的挑战为理解上述异质性可能如何影响功效、效能、免疫原性和清除。关于电荷对皮下(sc)给予mabs的pk的影响知之甚少。通过间质组织进入脉管或淋巴毛细管可对sc给予后的有效药物吸收造成障碍。mabs的间质扩散可能受其电荷以及其与皮肤真皮下的间质区域中的带负电荷组分的静电相互作用影响。最近，生物仿制药开发的增长和兴趣对于生产生物治疗药物例如mabs呈现出几个独特挑战。创新分子的发展允许自由定义开发过程的自然过程期间mab的产品质量属性(pqas)，和最终地，关键质量属性(cqas)。该范例继而允许实现潜在稳健的能够处理mabs的生产平台，候选物产品线(pipeline)可以以最小优化产生。相比之下，生物仿制药分子的开发强加(由参考产品)预定义的产品质量属性范围集合的界线。对过程开发的影响为平台过程可提供的自由可能由于需要符合多个pqas的定义范围而显著减少。这对于已知生物学相关的或可潜在地生物学相关的那些属性尤其如此，例如上述电荷变体。纯化或减少这样的异质性以达到更同质的群体对过程开发者提出重大挑战。构成电荷变体的异质群体的物类差异常常相当微小，并且其特征与主要的目的mab群体相似。因此，这些不需要的变体难以有效分离同时维持合理的mab回收。有必要使这些不需要的变体最少化，以得到更同质的生物仿制药mabs群体。发明概述本公开内容的特征在于用于提高或减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平的方法。另外，本公开内容的特征还在于用于减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的高分子量物类、酸性物类和片段的水平的方法。本文提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，向培养物注入约0.5g/l-约5g/l岩藻糖使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少，从而减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法。还提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，从培养的第1天、第2天、第3天或第4天开始，并每隔一天继续，直至培养结束，向培养物注入约0.5g/l-约5g/l岩藻糖使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少，从而减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法。根据本公开内容的方法，单克隆抗体可特异性结合肿瘤坏死因子(tnf)α。同样地，根据本公开内容的方法，重组细胞可包括哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞、hek293细胞、sp2/0细胞或可在生物反应器中生长用于单克隆抗体表达的任何其它合适的细胞)。在任何本文所公开的方法中，可向培养物注入约1g/l-约5g/l岩藻糖、约1g/l-约4g/l岩藻糖、约1g/l-约3g/l岩藻糖、约1g/l-约2g/l岩藻糖和/或约2g/l-约4g/l岩藻糖。在一些实施方案中，岩藻糖以推注注入。在本公开内容的方法的一些实施方案中，培养物为连续进料培养物，其中从培养的第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在24小时的时期内向培养物进一步连续注入进料培养基。在本公开内容的方法的其它实施方案中，培养物为长期进料培养物，其中从培养的第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在约18-约20小时的时期内向培养物进一步连续注入进料培养基。示例性的非岩藻糖基化物类包括g0聚糖、g1a聚糖、g1b聚糖、g2聚糖、man3聚糖、man4聚糖、man5聚糖、man6聚糖、man7聚糖、man8聚糖和/或9聚糖，或其任何组合。在一个非限制性的优选的实施方案中，非岩藻糖基化物类为g0聚糖。根据本公开内容的方法，单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约10%或更少，减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约2%-约10%，减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约6%或更少，和/或减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约3%-约7%。在本公开内容的方法中，表达单克隆抗体的重组细胞可在生物反应器中培养至少12天。还提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在24小时的时期内连续向培养物注入进料培养基以足以提高单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平，从而提高非岩藻糖基化物类的方法。同样地，提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在约18-约20小时的时期内连续向培养物注入进料培养基以足以提高单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平，从而提高非岩藻糖基化物类的方法。细胞培养物的这种连续或长期进料可提高一种或多种单克隆抗体物类，包括一种或多种g0聚糖、g1a聚糖、g1b聚糖、g2聚糖、man3聚糖、man4聚糖、man5聚糖、man6聚糖、man7聚糖、man8聚糖或man9聚糖，包括其任何组合。在一个实施方案中，细胞培养物的连续或长期进料可提高一种或多种单克隆抗体物类，包括g0聚糖。细胞培养物的连续或长期进料可使单克隆抗体的非岩藻糖基化物类提高至细胞所表达的单克隆抗体的总量的1%-约10%，包括至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约1%-约5%、细胞所表达的单克隆抗体的总量的约5%-约10%、细胞所表达的单克隆抗体的总量的约7%-约10%、至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约8%-约10%或至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约8.5%-约9.5%。细胞培养物的连续或长期进料可使单克隆抗体的g0非岩藻糖基化物类提高至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约6%-约9%，包括至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约6%-约8%、细胞所表达的单克隆抗体的总量的约6%-约7%或细胞所表达的单克隆抗体的总量的约7%-约8%。还提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在24小时的时期内连续向培养物注入进料培养基以足以减少单克隆抗体的高分子量物类、酸性电荷物类和片段中的一种或多种，从而减少单克隆抗体的高分子量物类、酸性物类和片段的水平的方法。同样地，还提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在约18-约20小时的时期内连续向培养物注入进料培养基以足以减少单克隆抗体的高分子量物类、酸性电荷物类和片段中的一种或多种，从而减少单克隆抗体的高分子量物类、酸性物类和片段的水平的方法。相对于推注-进料培养物所表达的抗体的高分子量物类、酸性物类和片段的水平，这种细胞培养物的连续或长期进料可减少单克隆抗体的高分子量物类、酸性物类和片段。通过按照连续或长期进料方案为细胞培养物进料，单克隆抗体的高分子量物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约5%或更少。通过按照连续或长期进料方案为细胞培养物进料，单克隆抗体的酸性电荷物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约5%或更少。通过按照连续或长期进料方案为细胞培养物进料，单克隆抗体的片段减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约5%或更少。任何本文所描述的这些方法均可用于减少一种或多种单克隆抗体片段，包括恒定区、可变区、重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdr1、轻链cdr2和/或轻链cdr3。在一些实施方案中，所述方法减少所有这些片段。然而，由于每一这些片段在大小上显著不同，单克隆抗体片段可差别地排除。另外，由于一些单克隆抗体片段是“功能上活性的”(可结合抗原)而其它的不是“功能上活性的”，本文所描述的方法可用于减少非功能活性的单克隆抗体片段。同样地，一些单克隆抗体片段(即，重链和轻链对，scfvs和vhh)可在治疗上使用。因此，在一些实施方案中，本文所描述的方法可用于通过减少组合物中非治疗活性的单克隆抗体片段的存在而分离变体抗体组合物。在任何前述方法或任何本文所描述或例示的方法中，单克隆抗体可为特异性结合肿瘤坏死因子(tnf)α的抗体。同样地，在任何前述方法，或任何本文所描述或例示的方法中，培养物为表达抗体的哺乳动物细胞培养物。细胞可为cho细胞、hek293细胞、ns0细胞、sp2/0细胞，或可在生物反应器中生长用于单克隆抗体表达的任何其它合适的细胞。任何本文所描述的方面和实施方案可与本文在发明概述、附图和/或发明详述中所公开的任何其它方面或实施方案组合，包括本发明的以下具体的、非限制性的实施例/实施方案。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另有清楚指示。尽管与本文所描述的那些相似或相当的方法和材料可用于实践和检验本申请，下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用结合。本文所引用的参考文献不承认为所要求保护的申请的现有技术。如果冲突，以本申请说明书，包括定义，为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，不意在限制。本申请的其它特征和优点将从下列详述连同实施例变得显而易见。附图简述图1a-1f显示过程a如何影响细胞培养和抗体制备的不同方面。图1a显示过程a如何影响培养期的活细胞密度。图1b显示过程a如何影响培养期的细胞活力。图1c显示过程a如何影响培养期的细胞滴度。图1d显示过程a如何影响培养期的酸性电荷物类水平。图1e显示过程a如何影响培养期的完整单克隆抗体(期需分子)的水平。图1f显示过程a如何影响培养期的g0非岩藻糖基化物类的水平。图2a-2f比较过程a(菱形)、b(方形)和c(三角形)，以及每一过程如何影响细胞培养和抗体制备的各个方面。图2a比较过程a、b和c如何影响培养期的活细胞密度。图2b比较过程a、b和c如何影响培养期的细胞活力。图2c比较过程a、b和c如何影响培养期的细胞滴度。图2d比较过程a、b和c如何影响培养期的酸性电荷物类水平。图2e比较过程a、b和c如何影响培养期的完整单克隆抗体(期需分子)的水平。图2f比较过程a、b和c如何影响培养期的g0非岩藻糖基化物类的水平。图3显示岩藻糖注入对g0非岩藻糖基化物类的水平的影响。这些数据比较两天岩藻糖注入(第4和6天)和4天岩藻糖注入(第4、6、8和10天)，与连续(每天)岩藻糖注入，以及无岩藻糖注入。图4显示岩藻糖注入对非岩藻糖基化物类的总水平的影响。这些数据比较两天岩藻糖注入(第4和6天)和4天岩藻糖注入(第4、6、8和10天)，与连续(每天)岩藻糖注入，以及无岩藻糖注入。图5显示岩藻糖注入对抗体滴度的影响。这些数据比较两天岩藻糖注入(第4和6天)和4天岩藻糖注入(第4、6、8和10天)，与连续(每天)岩藻糖注入，以及无岩藻糖注入。图6显示岩藻糖注入对酸性物类的水平的影响。这些数据比较两天岩藻糖注入(第4和6天)和4天岩藻糖注入(第4、6、8和10天)，与连续(每天)岩藻糖注入，以及无岩藻糖注入。图7显示岩藻糖注入对完整抗体的水平的影响。这些数据比较两天岩藻糖注入(第4和6天)和4天岩藻糖注入(第4、6、8和10天)，与连续(每天)岩藻糖注入，以及无岩藻糖注入。图8显示非岩藻糖基化聚糖的表示。发明详述关于本发明的方面的各个术语贯穿整个说明书和权利要求书使用。这样的术语被给予其在本领域中的普通含义，除非另有说明。其它特别定义的术语以与本文所提供的定义一致的方式解释。如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非另有明确说明。如本文所使用的，术语“包括”、“具有”和“包含”包括更限制的术语“基本上由…组成”和“由…组成”。术语受试者和患者可互换地使用，并且包括任何动物。受试者包括哺乳动物，包括伴侣动物和农场动物，以及啮齿类，包括小鼠、兔和大鼠以及其它啮齿类。在一些实施方案中，非人灵长类为优选的受试者，且人为高度优选的受试者。如本文所使用的，术语“单克隆抗体的高分子量物类”指抗体聚集体，包括，例如，抗体二聚体、三聚体和多聚体形成物。如本文所使用的，术语“单克隆抗体的酸性电荷物类”指引起酸性电荷变体的抗体的翻译后修饰，如与主要物类(无修饰)和碱性电荷变体相比的。如本文所使用的，单克隆抗体的“片段”包括，但不限于恒定区、可变区、重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdr1、轻链cdr2和/或轻链cdr3。“功能活性”的片段可包括能够结合抗原的任何单克隆抗体片段。如本文所使用的，术语“非岩藻糖基化的单克隆抗体”指经工程改造以致抗体fc区域中的寡糖不具有任何岩藻糖糖单元的单克隆抗体。当抗体为非岩藻糖基化时，效果为增加抗体依赖的细胞毒性(adcc)。典型的生物反应器(例如，发酵)细胞培养从基础培养基开始，培养开始后定期注入营养物，直至完成培养。该注入一般为进料培养基，并在蛋白表达期期间维持细胞培养。大多数情况下，进料培养基注入经由推注注入进行，且浓缩的进料培养基在设定的时间点迅速加入细胞培养物中，通常每天一次。当生物反应器培养用于表达单克隆抗体时，单克隆抗体制备物包含不期需的杂质，其包括抗体的电荷变体物类、抗体片段、抗体聚集体和其它变体物类。这些杂质在结构上与期需的单克隆抗体相关，一般难以在后续纯化过程例如层析期间去除，这是因为纯化过程不足够敏感以完全区分期需的抗体产物和不期需的物类、片段等。包含期需抗体的变体物类、片段、聚集体和其它不期需的变体影响抗体制备物的最终效能。在抗体的非岩藻糖基化变体的情况下，例如，抗体的这种非岩藻糖基化物类影响免疫效应功能，例如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)，这部分由抗体fc上的糖基化模式和具体地，聚糖部分中的岩藻糖水平实现。因此，除了其它性质之外，能够控制抗体物类和变体以调节效能和adcc是期需的。在生物仿制药抗体生产的情况下，进一步期需控制这样的物类和变体以便抗体制备物足以匹配参考产品，以通过监管审查和维持作为生物仿制药产品的状态。根据本发明，已观察到生物反应器细胞培养条件，具体地，进料方案和类型对特定变体物类的水平具有直接作用。观察到从推注进料到更长期的或甚至连续的进料的变化显著减少生物反应器中表达的单克隆抗体制备物中酸性电荷变体和抗体片段的水平。另外，观察到进料技术的这种变化还增强细胞培养物的健康。然而，该变化的一个结果为抗体的非岩藻糖基化物类的水平显著提高。尽管提高的非岩藻糖基化物类水平在一些情况下为期需的，但提高的非岩藻糖基化物类水平在其它情况下不期需。因此，为了维持改变的进料方案的益处但减少其中提高的水平为不期需的抗体制备物中非岩藻糖基化物类的水平，进行实验以确定如何减少非岩藻糖基化物类而不导致对有益的进料方案的任何危害或对抗体制备的任何新危害。根据这样的实验，观察到按照特定的注入方案向生物反应器细胞培养物注入岩藻糖能够实现非岩藻糖基化物类减少而不提高表达的单克隆抗体的其它物类或变体的水平，以及不负面影响细胞培养物的整体健康。因此，本发明的特征在于用于减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的电荷变体、片段和聚集体的水平的方法。另外，本发明特征在于用于调节生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平的方法。所述方法可单独或一起使用。用于减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法一般涉及在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后向培养物注入约0.5g/l-约5g/l岩藻糖，使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少。岩藻糖的注入开始并在时间安排方式上与向细胞培养物注入进料培养基一致。在某些实施方案中，优选岩藻糖注入不在开始进料培养基注入之前的数天内发生。岩藻糖和/或进料培养基注入可根据本领域的任何合适的技术，例如经由与生物反应器细胞培养物连通的孔。在岩藻糖补充到进料培养基中的情况下，进料经由蠕动泵和管道以期需的速率注入。如果岩藻糖单独加入(推注)，那么其在大约2-5分钟内注入。任何合适的进料培养基可注入细胞培养物中。进料培养基一般市售可得，并且这种商业生产的进料培养基适合用于本文所描述或例示的方法中。进料培养基可包括本文所描述或例示的任何培养基。注入进料培养基可在多日生物反应器细胞培养的约第1天、约第2天、约第3天、约第4天、约第5天、约第6天或约第7天开始，并在其后继续，直至细胞培养结束。细胞培养可为至少约7天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天或超过24天。细胞培养可持续约10天-约21天、约10天-约14天、约10天-约12天或约11天-约13天。注入进料培养基和注入岩藻糖在培养的约第3天、约第4天或约第5天开始，并在其后每天继续，直至培养结束。注入进料培养基和岩藻糖可在培养的约第1天或约第2天开始，并在其后每天继续，直至培养结束。进料培养基的注入按照长期进料方案、连续进料方案或者长期进料方案和连续进料方案的组合。连续进料方案涉及在24小时的时期内向细胞培养物连续注入进料培养基。平常将作为推注注入的相同量/浓度的进料培养基被注入培养物中，但该量分配为在24小时内基本均匀地注入。相对于将在每次推注中注入的量/浓度，更高量/浓度的进料培养基在24小时内注入。相对于将在每次推注中注入的量/浓度，更少量/浓度的进料培养基在24小时内注入。因此，在连续进料方案中，从开始进料培养基注入直至细胞培养结束，或直至期需结束向细胞培养物注入进料培养基，进料培养基不断地被注入细胞培养物中。长期进料方案涉及在比推注注入长的时期内向细胞培养物注入进料培养基，但不在完整的24小时内。推注注入包括在约5分钟-约1小时的时期内注入。一般而言，推注注入在约5分钟-约15分钟的时期内进行。长期进料方案将向细胞培养物内递送进料培养基延长至约6小时-约23小时的时期。长期进料方案将向细胞培养物内递送进料培养基延长至约8小时-约18小时、约12小时-约22小时、约12小时-约20小时、约12小时-约18小时、约16小时-约22小时、约16小时-约20小时、约16小时-约18小时或约17小时-约19小时的时期。在一些实施方案中，约18小时的长期进料时期是优选的。在从长期进料时期结束至24小时点的剩余时间期间，无进料培养基注入细胞培养物中。因此，在长期进料方案下，从进料培养基注入开始直至细胞培养结束，或直至期需结束向细胞培养物注入进料培养基，在长期进料时期(接着为直至约24小时标志的间断)内每天将进料培养基注入细胞培养物中。岩藻糖注入可遵循进料培养基注入方案。因此，例如，如果进料培养基注入从培养的第4天开始，岩藻糖注入也从培养的第4天开始。在一些实施方案中，优选岩藻糖注入不在进料培养基注入之前。岩藻糖注入可与进料培养基注入同时。例如，当使用长期进料方案时，岩藻糖在注入进料培养基期间的一些时间点注入，但不在无进料培养基注入的时期期间注入。岩藻糖注入可为推注注入，而非长期进料注入或连续注入。因此，岩藻糖在约5分钟-约1小时或约5分钟-约15分钟的时期内以浓缩的形式注入细胞培养物中。在其中岩藻糖注入结合连续进料方案或长期进料方案使用时，岩藻糖注入为每天的或至少每隔一天，并且大约为每天的相同时间以确保每24小时的时期有至少一次岩藻糖注入。一旦开始，岩藻糖注入每天或至少每隔一天发生，从进料培养基注入开始，直至细胞培养结束，或直至期需结束向细胞培养物中注入进料培养基，或直至期需结束岩藻糖注入。在一些优选的实施方案中，每天注入细胞培养物中的岩藻糖的量为相同的量，尽管在不同的天更多或更少量的岩藻糖可注入培养物中。注入的岩藻糖的量为有效将生物反应器表达的制备物中单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平减少至期需水平的量。例如，在生物仿制药背景下，期需的水平可为近似参考抗体制备物中存在的非岩藻糖基化物类的水平的水平。在实施方案中，约0.05g每升细胞培养物(g/l)-约10g每升(g/l)细胞培养物的岩藻糖，例如，作为推注，每天注入。在一些实施方案中，约0.05g/l-约5g/l岩藻糖、约0.1g/l-约10g/l、约0.1g/l-约3g/l岩藻糖、约0.1g/l-约2g/l、约0.5g/l-约10g/l岩藻糖、约1g/l-约10g/l、约1g/l-约5g/l、约1g/l-约4g/l、约1g/l-约3g/l、约1g/l-约2g/l、约2g/l-约5g/l、约2g/l-约4g/l、约2g/l-约3g/l、约3g/l-约5g/l、约3g/l-约4g/l或约4g/l-约5g/l细胞培养物的岩藻糖，例如作为推注，每天注入。细胞培养物可为生物反应器细胞培养物，例如，发酵细胞培养物。在某些优选的实施方案中，细胞为重组的，并且表达单克隆抗体。在某些实施方案中，细胞可为真核的，哺乳动物细胞为最优选的。适于按照本文所描述或例示的方法表达单克隆抗体的哺乳动物细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚胎肾293(hek293)细胞、sp2/0细胞和ns0细胞。所述方法适合用于生物反应器中的这种细胞所表达的任何单克隆抗体。在一些优选的实施方案中，单克隆抗体特异性结合肿瘤坏死因子(tnf)α。可使用特异性结合tnfα的任何单克隆抗体，包括，但不限于美国专利号6,090,382中所描述的抗体。在一些优选的实施方案中，抗体为全长单克隆抗体，包括可变和恒定区二者。抗体可具有重链恒定区和/或轻链恒定区。抗体可包括全长抗体的衍生物或片段或部分，其保留抗原结合特异性，并且还保留全长抗体分子的大部分或所有亲和力。抗体可包含翻译后修饰(ptms)或部分，其可影响抗体活性或稳定性。抗体可经甲基化、乙酰化、糖基化、硫酸化、磷酸化、羧化和/或酰胺化，并且可包含本领域所熟知的其它部分。连续进料和长期进料方案可用以提高单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的浓度。提高可通过向生物反应器细胞培养物中注入岩藻糖缓和。然而，向生物反应器细胞培养物注入岩藻糖可用于一般地抑制非岩藻糖基化的抗体物类产生，无论是否使用连续进料或长期进料方案，例如，如本文作为适于减少抗体制备物中的其它非期需抗体变体和物类所描述和例示的。注入岩藻糖也可连同推注进料方案(用于向细胞培养物注入进料培养基)使用。因此，根据本公开内容，非岩藻糖基化物类的水平可调节。非岩藻糖基化物类可包括包含任何一种或多种g0聚糖、g1a聚糖、g1b聚糖、g2聚糖、man3聚糖、man4聚糖、man5聚糖、man6聚糖、man7聚糖、man8聚糖或man9聚糖(图8)的单克隆抗体。所述方法可用于调节包含g0聚糖的单克隆抗体物类的水平。非岩藻糖基化物类可包括包含g0聚糖、g1聚糖、g2聚糖、man5聚糖和man6聚糖的单克隆抗体。在一些实施方案中，非岩藻糖基化物类包括g0聚糖和man5聚糖。对于抗tnf单克隆抗体，g0聚糖可包括约3%-约7%，g1聚糖可包括约0.8%-约2%，man5聚糖可包括约0.8%-约1.8%的生物反应器中所表达的单克隆抗体。岩藻糖注入可使单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平减少至制备物中单克隆抗体的总量(包括期需抗体分子以及其物类和变体在内的单克隆抗体的总量)的约20%或更少。岩藻糖注入可使非岩藻糖基化物类的水平减少至制备物中单克隆抗体的总量的约10%或更少。单克隆抗体的总量包括期需的主要单克隆抗体以及所有变体物类，包括酸性物类、碱性物类、非岩藻糖基化物类、聚集体、高分子量物类、片段和其它抗体物类。岩藻糖注入可使非岩藻糖基化物类的水平减少至制备物中单克隆抗体的总量的约9%或更少、约8%或更少、约7%或更少、约6%或更少、约5%或更少、约4%或更少、约3%或更少、约2%或更少或约1%或更少。岩藻糖注入可使非岩藻糖基化物类的水平减少至制备物中单克隆抗体的总量的约1%-约20%、约1%-约15%、约1%-约12%、约1%-约10%、约1%-约8%、约1%-约6%、约2%-约16%、约2%-约13%、约2%-约10%、约2%-约8%、约2%-约6%、约3%-约8%、约3%-约6%、约3%-约5%、约4%-约18%、约4%-约12%、约4%-约8%、约4%-约6%、约5%-约15%、约5%-约10%、约6%-约18%、约6%-约12%、约8%-约15%、约8%-约12%或约10%-约20%。观察到在细胞培养过程中推注注入进料培养基产生(总抗体制备物的)约6-7%的非岩藻糖基化物类抗体的水平。约5%的总抗体制备物，或约70-85%的总的非岩藻糖基化物类包含g0聚糖物类。进一步观察到长期进料或连续进料(注入进料培养基)方案在减少抗体的高分子量物类、酸性物类和片段的水平的同时，使非岩藻糖基化物类的水平提高至总抗体制备物的约8.5-9.5%。在这些进料方案下，约6-7%的总抗体制备物，或约60-75%的总的非岩藻糖基化物类包含g0聚糖物类。当与长期进料或连续进料方案偶联时，岩藻糖注入减少抗体的非岩藻糖基化物类的总体水平和抗体的g0聚糖物类的水平二者。该减少可经调整达到推注进料水平，或者如果期需，可使该减少低于推注进料水平。岩藻糖注入不提高长期进料或连续减料减少的抗体的高分子量、酸性或片段物类或变体的水平。岩藻糖注入可使总的非岩藻糖基化物类的水平减少细胞培养物中所产生的非岩藻糖基化抗体物类的水平的约1%-约99%或更多，在所述细胞培养物中无岩藻糖注入，或在所述细胞培养物中岩藻糖没有基本上每天与进料培养基注入同时注入。在一些实施方案中，岩藻糖注入可使总的非岩藻糖基化物类的水平减少细胞培养物中所产生的非岩藻糖基化抗体物类的水平的约5%-约80%、约5%-约70%、约5%-约60%、约5%-约50%、约5%-约40%、约5%-约30%、约5%-约20%、约10%-约70%、约10%-约60%、约10%-约50%、约10%-约40%、约10%-约30%、约10%-约20%、约20%-约60%、约20%-约50%、约20%-约40%、约20%-约30%、约30%-约60%、约30%-约50%、约30%-约40%、约40%-约70%、约40%-约60%、约50%-约80%、约50%-约70%或约50%-约60%，在所述细胞培养物中无岩藻糖注入，或在所述细胞培养物中岩藻糖没有基本上每天与进料培养基注入同时注入。岩藻糖注入可减少推注进料、长期进料或连续进料的细胞培养物中所产生的非岩藻糖基化物类的水平。岩藻糖注入可使g0聚糖物类的水平减少细胞培养物中所产生的g0聚糖抗体物类的水平的约1%-约99%或更多，在所述细胞培养物中无岩藻糖注入，或在所述细胞培养物中岩藻糖没有基本上每天与进料培养基注入同时注入。岩藻糖注入可使g0聚糖物类的水平减少细胞培养物中所产生的g0聚糖抗体物类的约5%-约80%、约5%-约70%、约5%-约60%、约5%-约50%、约5%-约40%、约5%-约30%、约5%-约20%、约10%-约70%、约10%-约60%、约10%-约50%、约10%-约40%、约10%-约30%、约10%-约20%、约20%-约60%、约20%-约50%、约20%-约40%、约20%-约30%、约30%-约60%、约30%-约50%、约30%-约40%、约40%-约70%、约40%-约60%、约50%-约80%、约50%-约70%或约50%-约60%，在所述细胞培养物中无岩藻糖注入，或在所述细胞培养物中岩藻糖没有基本上每天与进料培养基注入同时注入。岩藻糖注入可减少推注进料、长期进料或连续进料的细胞培养物中所产生的g0聚糖物类的水平。用于提高生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法一般包括在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后按照长期进料或连续进料方案，例如，本文所描述和例示的长期进料和连续进料方案，包括以上关于岩藻糖注入所描述的那些，向培养物注入进料培养基。连续进料和长期进料，而不注入岩藻糖，提高单克隆抗体的非岩藻糖基化物类，特别是g0聚糖物类的水平。另外，相对于推注进料方案，虽然非岩藻糖基化物类的水平提高，但这种连续进料和长期进料减少其他抗体物类例如抗体的高分子量物类、酸性电荷物类和片段的水平。在这方面，认为由于至少酸性电荷物类的减少，主要抗体的水平提高。换言之，较少的酸性物类在总的抗体制备物中产生，且制备物中酸性物类的百分比损失由主要抗体百分比的增长补足。任何合适的进料培养基均可注入细胞培养物中。进料培养基一般市售可得，并且这种商业生产的进料培养基适合用于本文所描述的或例示的方法。进料培养基可包括本文所描述的或例示的任何培养基。注入进料培养基可从多日生物反应器细胞培养的约第1天、约第2天、约第3天、约第4天、约第5天、约第6天或约第7天开始，并在其后继续，直至细胞培养结束。细胞培养可为至少约7天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天或超过24天。细胞培养可持续约10天-约21天、约10天-约14天、约10天-约12天或约11天-约13天。连续进料方案涉及在24小时的时期内连续向细胞培养物注入进料培养基。在一些实施方案中，将通常将作为推注注入的相同量/浓度的进料培养基注入培养物中，但该量分配为在24小时内基本均匀地注入。相对于将在每次推注中注入的量/浓度，更高量/浓度的进料培养基在24小时内注入。相对于将在每次推注中注入的量/浓度，更少量/浓度的进料培养基在24小时内注入。因此，在连续进料方案中，从开始进料培养基注入直至细胞培养结束，或直至期需结束向细胞培养物注入进料培养基，进料培养基不断地被注入细胞培养物中。长期进料方案涉及向细胞培养物注入进料培养基，持续比推注注入长的时期，但不超过整个24小时。推注注入包括在约5分钟-约1小时的时期内注入。一般而言，推注注入在约5分钟-约15分钟的时期内进行。长期进料方案将向细胞培养物内递送进料培养基延长至约6小时-约23小时的时期。长期进料方案将向细胞培养物内递送进料培养基延长至约8小时-约18小时、约12小时-约22小时、约12小时-约20小时、约12小时-约18小时、约16小时-约22小时、约16小时-约20小时、约16小时-约18小时或约17小时-约19小时的时期。在一些实施方案中，约18小时的长期进料时期是优选的。在从长期进料时期结束至24小时点的剩余时间期间，无进料培养基注入细胞培养物中。因此，在长期进料方案下，从进料培养基注入开始直至细胞培养结束，或直至期需结束向细胞培养物注入进料培养基，在长期进料时期(接着为直至约24小时标志的间断)内，每天将进料培养基注入细胞培养物中。细胞培养物的长期进料或连续进料可使总的非岩藻糖基化物类的水平提高经由进料培养基的推注进料而进料的细胞培养物中所产生的非岩藻糖基化的抗体物类的水平的约1%-约99%或更多。细胞培养物的长期进料或连续进料可使总的非岩藻糖基化物类的水平提高经由进料培养基的推注进料而进料的细胞培养物中所产生的非岩藻糖基化的抗体物类的水平的约5%-约60%、约5%-约50%、约5%-约40%、约5%-约30%、约5%-约20%、约5%-约15%、约5%-约10%、约10%-约50%、约10%-约40%、约10%-约30%、约10%-约20%、约10%-约15%、约20%-约80%、约20%-约70%、约20%-约60%、约20%-约50%、约20%-约40%、约20%-约30%、约30%-约80%、约30%-约70%、约30%-约60%、约30%-约50%、约30%-约40%、约40%-约90%、约40%-约80%、约40%-约70%、约40%-约60%、约50%-约90%、约50%-约80%、约50%-约70%、约50%-约60%、约60%-约90%、约60%-约80%、约60%-约70%、约70%-约90%或约75%-约85%。细胞培养物的长期进料或连续进料可使g0聚糖抗体物类的水平提高经由进料培养基的推注进料而进料的细胞培养物中所产生的g0聚糖抗体物类的水平的约1%-约99%或更多。细胞培养物的长期进料或连续进料可使g0聚糖抗体物类的水平提高经由进料培养基的推注进料而进料的细胞培养物中所产生的g0聚糖抗体物类的水平的约5%-约60%、约5%-约50%、约5%-约40%、约5%-约30%、约5%-约20%、约5%-约15%、约5%-约10%、约10%-约50%、约10%-约40%、约10%-约30%、约10%-约20%、约10%-约15%、约20%-约80%、约20%-约70%、约20%-约60%、约20%-约50%、约20%-约40%、约20%-约30%、约30%-约80%、约30%-约70%、约30%-约60%、约30%-约50%、约30%-约40%、约40%-约90%、约40%-约80%、约40%-约70%、约40%-约60%、约50%-约90%、约50%-约80%、约50%-约70%、约50%-约60%、约60%-约90%、约60%-约80%、约60%-约70%、约70%-约90%或约75%-约85%。细胞培养物的长期进料或连续进料可使总的非岩藻糖基化物类的水平提高至细胞培养物中所产生的单克隆抗体的总水平的约0.5%-约20%。细胞培养物的长期进料或连续进料使总的非岩藻糖基化物类的水平提高至细胞培养物中所产生的单克隆抗体的总水平的约1%-约15%、约1%-约5%、约1%-约7%、约1%-约5%、约1%-约3%、约2%-约7%、约2%-约10%、约2%-约5%、约2%-约4%、约3%-约10%、约3%-约9%、约3%-约6%、约3%-约5%、约4%-约12%、约4%-约10%、约4%-约8%、约4%-约7%、约4%-约6%、约5%-约17%、约5%-约15%、约5%-约13%、约5%-约12%、约5%-约11%、约5%-约10%、约5%-约9%、约5%-约8%、约5%-约7%、约5%-约6%、约6%-约20%、约6%-约15%、约6%-约13%、约6%-约12%、约6%-约11%、约6%-约10%、约6%-约9%、约7%-约18%、约7%-约15%、约7%-约13%、约7%-约12%、约7%-约11%、约7%-约10%、约7.5%-约9.5%、约8%-约15%、约8%-约13%、约8%-约12%、约8%-约11、约8%-约10%、约8%-约9%、约8.5%-约9.5%、约9%-约15%、约9%-约13%、约9%-约12%、约9%-约11%、约9%-约10%、约10%-约15%、约10%-约13%或约10%-约12%。长期进料或连续进料细胞培养可相对于推注进料的细胞培养物所表达的非岩藻糖基化物类的水平提高非岩藻糖基化物类的水平。细胞培养物的长期进料或连续进料可使g0聚糖物类的水平提高至细胞培养物中所产生的单克隆抗体的总水平的约5%-约15%。细胞培养物的长期进料或连续进料可使g0聚糖物类的水平提高至细胞培养物中所产生的单克隆抗体的总水平的约5%-约14%、约5%-约13%、约5%-约12%、约5%-约11%、约5%-约10%、约5%-约9%、约5%-约8%、约5%-约7%、约5%-约6%、约6%-约15%、约6%-约14%、约6%-约13%、约6%-约12%、约6%-约11%、约6%-约10%、约6%-约9%、约6%-约8%、约6%-约7%、约7%-约15%、约7%-约13%、约7%-约12%、约7%-约11%、约7%-约10%、约7%-约9%或约7%-约8%。长期进料或连续进料细胞培养可相对于推注进料的细胞培养物所表达的g0聚糖物类的水平提高g0聚糖物类的水平。提供下列实施例以更详细地描述本发明。其意在说明而非限制本发明。实施例1基础进料策略进行这些实验以开发解决控制生物反应器生产治疗性单克隆抗体期间建立的异质性的复杂挑战的纯化过程。对于基础/进料培养基的上游过程开发从利用台式生物反应器的等比例缩小模型的培养基筛选实验开始。该筛选评估与几种进料培养基类型交叉的几种基础培养基类型，以确定适当的组合。产品质量和生产率在培养基选择所使用的标准之中。选择基础/进料培养基之后，产品质量和生产率通过改变过程参数和加入补充剂监测和调节。尺寸排阻层析(se-uplc)用于监测抗体尺寸变体分布。该方法为用磷酸钠运行缓冲液而等度的，使用watersacquityuplcbeh200sec柱(1.7µm,4.6x150mm)。峰使用280nm处的吸光度监测。单体峰之前洗脱的物类为聚集体(高mw物类)，单体峰之后洗脱的峰为降解物(低mw物类)。阳离子交换hplc(cex-hplc)用于通过在ph范围5.6-8.0内的弱阳离子交换层析监测带电荷的物类，包括c-端变体。主峰之后洗脱的不同的峰认为是碱性物类，而主峰之前洗脱的峰认为是酸性物类。碱性峰包含c-端赖氨酸和酰胺化的脯氨酸变体。修饰例如糖化和脱酰胺可在酸性峰中存在。对于基础过程，选择化学限定的(cd)和无动物组分的基础培养基。如果其包含足够的营养物以维持细胞生长约4-5天并且维持细胞活力≥95%，选择该培养基。营养物选择为以这样的方式平衡，废物和代谢产物在可接受的浓度内。对于在基础过程中使用，筛选了5种基础培养基(表1)。表1.筛选的基础培养基对于基础过程，选择化学限定的(cd)和无动物组分的进料培养基。培养基选择为维持细胞生长4-5天并且维持细胞活力≥95%。营养物选择为以这样的方式平衡，废物和代谢产物在可接受的浓度内。对于在基础过程中使用，筛选的进料培养基在表2中示出。表2.筛选的进料培养基进行设计研究以评估基础和进料培养基之间的关系(表3和4)。该研究的目标为开发结合基础和进料培养基且提供大的生长、活力和适当的抗体表达的基础过程。一旦满足标准，基础和进料培养基被选择为基础过程。表3.基础和进料培养基筛选，检验#1基础培养基进料培养基进料体积进料日cdchoagtbalancdcho110%4,6,8balancdchoslxabalancdcho110%4,6,8cdoptichochoefficientc10%4,6,8balancdchoslxabalancdcho110%4,6,8hycellbalancdcho110%4,6,8balancdchoslxacellboost5%4,6,8balancdchoslxachoefficientc10%4,6,8cdoptichocellboost5%4,6,8hycellcellboost5%4,6,8cdoptichobalancdcho110%4,6,8cdchoagtchoefficientc10%4,6,8cdoptichochoefficientc10%4,6,8hycellcellboost5%4,6,8hycellbalancdcho110%4,6,8cdchoagtcellboost5%4,6,8cdchoagtcellboost5%4,6,8cdchoagtbalancdcho110%4,6,8cdoptichocellboost5%4,6,8balancdchoslxacellboost5%4,6,8hycellchoefficientc10%4,6,8balancdchoslxachoefficientc10%4,6,8hycellchoefficientc10%4,6,8cdoptichobalancdcho110%4,6,8cdchoagtchoefficientc10%4,6,8表4.基础和进料培养基筛选，检验#2基础培养基进料培养基进料体积进料日cdfortichobalancdcho310%1,3,5balancdslxachoefficientb10%2,4,6,8cdfortichochoefficientc10%2,4,6,8hycellchoefficienta+b10%2,4,6,8cdfortichochoefficienta+b10%2,4,6,8hycellchoefficientb10%2,4,6,8cdchoagtbalancdcho310%1,3,5cdfortichocellboost55%4,6,8,10,12balancdslxabalancdcho310%1,3,5balancdslxachoefficientc10%2,4,6,8cdchoagtchoefficienta+b10%2,4,6,8cdoptichobalancdcho210%1,3,5cdoptichochoefficientb10%2,4,6,8cdoptichochoefficientc10%2,4,6,8hycellbalancdcho110%1,3,5cdoptichocellboost55%4,6,8,10,12balancdslxacellboost55%4,6,8,10,12cdfortichochoefficienta10%2,4,6,8cdchoagtchoefficientb10%2,4,6,8cdoptichobalancdcho110%1,3,5balancdslxachoefficienta10%2,4,6,8cdfortichobalancdcho210%1,3,5hycellbalancdcho310%1,3,5hycellchoefficientc10%2,4,6,8cdchoagtchoefficientc10%2,4,6,8cdoptichochoefficientc10%2,4,6,8balancdslxachoefficienta+b10%2,4,6,8hycellchoefficientc10%2,4,6,8hycellcellboost510%2,4,6,8cdoptichochoefficienta+b10%2,4,6,8hycellcellboost510%1,3,5hycellcellboost510%1,3,5balancdslxabalancdcho110%1,3,5cdfortichobalancdcho110%1,3,5hycellbalancdcho110%1,3,5balancdslxabalancdcho210%1,3,5cdchoagtbalancdcho110%1,3,5cdoptichochoefficienta10%2,4,6,8hycellcellboost55%4,6,8,10,12cdfortichochoefficientb10%2,4,6,8cdchoagtchoefficienta10%2,4,6,8hycellcellboost10%2,4,6,8cdoptichobalancdcho310%1,3,5cdoptichobalancdcho110%1,3,5hycellchoefficienta10%2,4,6,8cdchoagtbalancdcho210%1,3,5hycellbalancdcho210%1,3,5cdchoagtcellboost5%4,6,8,10,12从设计研究，以及摇瓶和生物反应器规模的实验，确定基线过程。选择hycell作为基础培养基，选择cdefficientfeedc作为进料培养基。进料培养基从第4天开始补充入培养物中，然后其后每隔一天向培养物额外进料，持续总计4次添加(“过程a”)。该基线过程的典型过程趋势在图1a(活细胞密度)、1b(%活力)、1c(滴度)、1d(酸性物类)、1e(完整抗体)和1f(g0非岩藻糖基化物类)中示出。实施例2进料策略经确定单克隆抗体制备物的一些属性可以以一定方式调节以改善某些关键质量属性(cqas)。该调节通过改变向细胞培养物中引入营养进料的方式达到。在上述实施例1中，基础过程基于特定的细胞密度，利用推注进料，且从生物反应器培养的第4天开始每隔一天将进料加入培养物中。推注进料包括每隔一天在总计约15分钟的时期内向细胞培养物加入营养物。但其后确定该进料策略影响蛋白制备物中某些方面的水平，包括高mw物类、抗体片段和电荷变体的水平。细胞培养过程中，观察到进料策略可调节某些关键质量属性(例如，电荷异质性、片段化、聚集等)。检验的生物反应器进料过程分类为推注进料：5-30min进料，从第4天开始每隔一天(过程a)，长期进料：10-18小时进料，从第4天开始每天(过程b)，或连续进料：每天24小时进料，从第4天开始每天(过程c)。观察到通过长期或连续的方式加入进料可改善所表达的抗体蛋白的一些质量属性(图2a-2f)，并且进一步观察到这种进料变更对生物仿制药抗体批次有益，这是因为所得的蛋白制备物更紧密匹配参考产品，减少对下游处理的需求。应注意，向生物反应器中进料的营养物的总量未变，取决于无论使用过程a、过程b或是过程c。而是，量的时间和分布在进料过程之间相应更改。进料的总量保持恒定，无论使用什么策略。按照过程b和过程c进料产生若干有益结果：增加的滴度、减少的酸性电荷变体累积、较多的完整mab(较少的片段)、较长的培养寿命和减少的聚集(图2a-2f)。实施例3非岩藻糖基化物类控制尽管对于按照过程b或过程c进料的生物反应器所观察到的有益结果(相对于过程a)，过程改变的一个结果为非岩藻糖基化物类，特别是g0物类的水平的增加。抗体(例如igg同种型)的糖基化影响分子的效应功能(例如抗体依赖的细胞毒性(adcc))。无岩藻糖或具有低岩藻糖的治疗性抗体显示增加的对活化fcγriiia的结合，并且相对于其高度岩藻糖基化的对等物，触发强adcc反应。在生物仿制药开发方面，非岩藻糖基化变体水平对生物仿制药抗体相对于参考抗体将如何表现具有影响。例如，如果相对于具有较低含量的参考产品，表达的生物仿制药具有增加的非岩藻糖基化含量，认为这可能导致生物仿制药相对于参考产品在体内触发更强的adcc反应。这种差异可导致抗体丧失作为生物仿制药的状态。更广泛来讲，提高任何治疗性抗体制备物(生物仿制药或非生物仿制药)中的非岩藻糖基化含量可在体内诱导不期需的adcc反应。因此，控制生物反应器中产生的非岩藻糖基化变体抗体的含量在某些治疗环境下是期需的。因此，更改进料策略以减少或消除某些不期需的抗体变体物类可同时又产生其它不期需的抗体变体物类；本质上，解决一个问题，而产生另一个问题。因此，进行根据本实施例的实验以达到两全其美—控制不期需的物类和控制非岩藻糖基化变体。注意提高非岩藻糖基化变体在一些环境中可为期需的。发现过程c提高抗体制备物的期需属性，但也提高g0非岩藻糖基化抗体变体的水平。为了减少非岩藻糖基化物类，进行几个实验，进一步改变进料过程。在一个这样的实验系列中，评估向生物反应器中加入岩藻糖。观察到按照过程c，降低非岩藻糖基化物类，特别是g0，可通过向细胞培养基中补充约1g/l-约3g/l的浓度的l-岩藻糖达到。施用途径也观察到为相关的。观察到最佳的结果在岩藻糖每天或每隔一天加入时观察到。还观察到在细胞培养的早期阶段岩藻糖的进料(一次或两次推注添加)不抑制非岩藻糖基化物类，特别是g0物类的增加(图3)。在一个实验中，岩藻糖加入仅在第4天和第6天发生(2次岩藻糖加入)。该岩藻糖加入具有起始的g0降低效果，但然后g0水平显著增加，g0水平基本符合对于其中不向培养物中加入补充的岩藻糖的培养物所观察到的水平。进一步的实验显示岩藻糖必须包含在整个细胞培养中，以减少非岩藻糖基化物类。发现每天或每隔一天推注加入岩藻糖使g0物类的水平降低至期需量。检查总的非岩藻糖基化物类(除g0物类之外)，观察到相同的趋势(图4)。仅向培养物中早期加入岩藻糖和不向细胞培养物中注入岩藻糖相对于向细胞培养物中更连续地加入岩藻糖产生更高量的非岩藻糖基化物类。如在图4中所见，总的非岩藻糖基化的岩藻糖水平在整个过程中保持相同。岩藻糖需要在整个培养持续时间内加入，因为如果仅在早期的几天加入，所发生的非岩藻糖基化物类的降低减退，并且非岩藻糖基化物类的水平随时间增加，如图3中所示。最优选的为当岩藻糖以4次推注添加而无连续进料添加加入时。实施例4概述这些数据指示能够调节生物反应器中表达的重组抗体的质量控制属性的上游过程。该过程组合更改的生物反应器进料过程，连同岩藻糖的连续加入。采用长期/连续进料策略过程和补充岩藻糖，该组合产生较少的与杂质相关的产物(例如，酸性物类，g0物类)。本发明不限于以上描述和例示的实施方案，而能够在所附权利要求书的范围内变更和修饰。等同物本发明的一个或多个实施方案的细节在以上附随的说明书中阐述。尽管任何与本文描述的那些相似或相等的方法和材料均可用于实践或检验本发明，但现在描述优选的方法和材料。前述说明书仅为了说明的目的呈现，并且不意在将本发明限制在所公开的精确形式，而是通过所附的权利要求书限制。当前第1页12