本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种pd-1纳米抗体及其克隆表达方法与应用。
背景技术：
肿瘤是全球致死率最高疾病之一，严重威胁人类健康；除手术、放射治疗外，肿瘤的治疗方法还包括：化学疗法、激素疗法、靶向药物疗法和肿瘤免疫疗法。自2013年《科学》杂志将肿瘤免疫疗法列为年度最重要科学突破后，近年来肿瘤免疫疗法愈发备受关注。
靶向阻断免疫检查点肿瘤免疫疗法逐渐成为了肿瘤治疗的关注热点，自2014年，fda先后批准默沙东的keytruda和百时美施贵宝的opdivo用于治疗黑色素瘤以来，靶向程序性死亡分子1(programmeddeath-1，pd-1，cd279)的抗体在临床上展示了优异、广谱的抗肿瘤活性，使得pd-1抑制剂成为目前肿瘤免疫治疗中最具前景的治疗药物。t细胞被激活后诱导pd-1表达，与其配体pd-l1(programmedcelldeath1ligand1)或pd-l2(programmedcelldeath1ligand2，pd-l2)结合后，itsm区的酪氨酸发生磷酸化，蛋白酪氨酸磷酸酶分子被招募，使得下游的效应分子去磷酸化，激活pd-1/pd-ls信号通路，转导负调节信号，抑制t细胞活化，下调免疫反应。正常情况下，该信号通路在维持t细胞稳态方面起关键性作用。但在肿瘤微环境中，肿瘤侵润淋巴细胞、肿瘤特异性t细胞及一些损伤相关的t细胞表面高表达pd-1分子，肿瘤表面pd-l1与t细胞表面pd-1结合后，传递抑制性信号，使t细胞活性下调，从而抑制机体对肿瘤的免疫反应，导致肿瘤产生免疫逃逸。由于pd-1、pd-l1广泛地参与到肿瘤免疫逃逸，因此，靶向并阻断pd-1/pd-ls通路可释放t淋巴细胞杀伤肿瘤的活性，从而有效抑制肿瘤进展。
目前上市或获批临床试验的pd-1抗体均是单克隆抗体(monoclonalanbibody,mab)(图1)，单克隆igg全抗体具有组织渗透性弱、免疫原性较强、成本高等先天不足，此外，靶向pd-1的全抗体半衰期长，有引起机体过度免疫的潜在风险。
1993年，hamerscasterman等从骆驼血清中分离出天然缺失轻链、仅含有重链的骆驼抗体，命名为重链抗体(heavy-chainantibody,hcab)。而vhh(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)是重链抗体上能特异性结合抗原的结构域，是通过基因工程技术克隆重链抗体的可变区，得到只由一个重链可变区组成的单域抗体。因为vhh晶体直径2.5nm，长4nm，所以vhh也被称为纳米抗体(nanobody，nb)。纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、高水溶性、高抗原结合性、高表达、强组织渗透性、低免疫原性以及半衰期短的特点，在治疗性抗体药物开发领域具有独特优势，目前尚未有具功能活性的pd-1纳米抗体药物的报道。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新的抗pd-1抗体(纳米抗体)。
本发明的另一目的在于提供所述的pd-1纳米抗体的克隆表达方法。
本发明的又一目的在于提供所述的pd-1纳米抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种程序性死亡分子1的纳米抗体(pd-1纳米抗体)，包含由框架区fr(frameworkregion)和互补决定区cdr(complementarity-determiningregions)组成的可变区结构域，所述的可变区结构域包含选自以下的cdr1、cdr2和cdr3：
(1)seqidno.1或seqidno.2所示的cdr1，
(2)seqidno.3所示的cdr2，
(3)seqidno.4或seqidno.5所示的cdr3。
所述的可变区结构域包含选自以下的cdr1、cdr2和cdr3：
(1)seqidno.1所示的cdr1，seqidno.3所示的cdr2和seqidno.4所示的cdr3；
(2)seqidno.2所示的cdr1，seqidno.3所示的cdr2和seqidno.5所示的cdr3。
所述的框架区fr选自下组的fr1、fr2、fr3和fr4：
(1)seqidno.6所示的fr1；
(2)seqidno.7或seqidno.8所示的fr2；
(3)seqidno.9所示的fr3；
(4)seqidno.10所示的fr4。
所述的pd-1纳米抗体的氨基酸序列选自如下任一序列所示：
qvqlqesgggsvqaggslrlscvasgfthlrysmgwfrqvldkeregvaaiggdgrtsyadsvkgrftifkdnakntlyldmnslnpedtamyycaaavlldgsfsllaplvpykydywgqgtqvtvss(seqidno.11)或
qvqlqesgggsvqaggslrlscvasgltylrysmgwfrqvpdkeregvaaiggdgrtsyadsvkgrftifkdnakntlyldmnslnpedtamyycaaavlldgsfsllapltpykydywgqgtqvtvss(seqidno.12)；
上述的氨基酸序列左侧开始为氨基端，右侧结束为羧基端，其顺序为：无下划线的序列分别是框架区：fr1～fr4；有下划线的是互补决定区，cdr1～cdr3。
所述的pd-1纳米抗体包含与seqidno.11或seqidno.12所示的任一氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列。
如seqidno.11或seqidno.12所示的任一氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。
所述的取代优选为与seqidno.11或seqidno.12所示的任一氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
编码所述的pd-1纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列，选自如下的(1)、(2)或(3)：
(1)如seqidno.13或seqidno.14所示的核苷酸序列；
(2)与seqidno.13或seqidno.14所示的核苷酸序列不同，但是编码如seqidno.11或seqidno.12所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
所述的pd-1纳米抗体，具有下述特征中的至少一个：
(1)阻断pd-1和pd-l1结合；
(2)逆转pd-l1引起的t细胞失活状态；
(3)抑制肿瘤生长。
一种核酸分子，编码所述的pd-1纳米抗体。
一种重组表达载体，含有编码所述的pd-1纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列的重组表达载体。
所述的表达载体为噬菌粒载体或者能编码所述pd-1纳米抗体氨基酸序列的其他细菌表达载体，以及酵母表达载体、真核细胞表达载体。
所述的噬菌粒载体优选为噬菌粒pmecs。
一种宿主细胞，其转化了所述的重组表达载体或者基因组上整合了所述的编码所述的pd-1纳米抗体的核苷酸序列的宿主细胞及其后代细胞。
所述的宿主细胞及其后代细胞指细菌细胞、真菌细胞、动物细胞或者植物细胞及这些宿主细胞的后代。
所述的宿主细胞优选为大肠杆菌；进一步优选为e.coliwk6。
所述的pd-1纳米抗体的克隆表达方法，包括如下步骤：
将编码所述的pd-1纳米抗体的核苷酸序列克隆入表达载体中，构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转入表达系统中进行表达；对目的蛋白进行分步纯化，最后得到所述的pd-1纳米抗体。
所述的pd-1纳米抗体在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。
所述的预防和/或治疗癌症药物优选为免疫检查点抑制剂药物。
所述的药物可为药物组合物，包括药学上可接受的载体。
所述的药物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可以包括本发明的pd-1纳米抗体联合至少一种其他的抗肿瘤药物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明的pd-1纳米抗体分子量小(约18kda)、特异性强、亲和力高，能抑制pd-l1与pd-1分子之间的相互作用，并且能特异识别细胞表面天然构象pd-1，阻断pd-l1与pd-1结合从而保持t细胞活性；具有与pd-1mab相同的结合能力。在体外pbmc活化模型中，本发明的pd-1纳米抗体能够逆转活化t细胞被pd-l1抑制的状态，上调ifn-γ的表达。
2.与pd-1单克隆抗体(本发明选择商业化鼠抗pd-1单克隆抗体作为对照)相比，本发明的纳米抗体(简写为nbpd-1，如seqidno.11或seqidno.12所示的nb2和nb3)的特异性与之相当，并且经过相同高温处理后本发明的纳米抗体的相对活性更高，热稳定性更好；具有开发成为免疫检查点抑制剂的潜力，为后续肿瘤治疗候选药物提供了物质材料。
3.本发明的pd-1纳米抗体克隆表达方法，经试管或摇瓶培养后，产量可达3.6mg/l～4.5mg/l，蛋白纯度超过93％，制备方法简单，成本低廉，未来可进一步优化培养条件并放大，以获得更高产量。
4.本发明成功构建了编码人pd-1胞外段(pd-1ecd)重组蛋白的真核表达质粒，通过表达纯化，获得纯度大于90％、具有功能活性的pd-1ecd重组蛋白，并以此为抗原，从大容量天然噬菌体纳米抗体库中筛选出两株分子量小、特异性强、亲和力高、热稳定性好的纳米抗体nb2和nb3。
附图说明
图1是现有技术中pd-1抗体研究现状的概况图。
图2是pd-1纳米抗体nb2和nb3的亲和力测定曲线图。
图3是pd-1纳米抗体nb2和nb3与市售pd-1单克隆抗体的热稳定性分析图；其中，a：25℃处理；b：37℃处理；c：60℃处理；d：90℃处理。
图4是pd-1纳米抗体nb2和nb3与pd-1mab的竞争结合实验的结果分析图；control为阴性对照。
图5是pd-1纳米抗体nb2和nb3与pd-l1的竞争结合实验的结果分析图；control为阴性对照。
图6是pd-1纳米抗体nb2和nb3与hek293t/pd-1细胞膜表面pd-1分子结合情况分析图；其中，a：pd-1mab组；b：nb2组；c：nb3组；d：为pd-1mab组、nb2组和nb3组的样品峰形数据叠加处理综合比较。
图7是pd-1纳米抗体nb2和nb3对pd-l1抑制t细胞活性的阻断效果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中相关试剂的配制：
1.rpmi1640/fbs培养基：89mlrpmi1640medium，10mlfbs，1ml双抗，1μghumanil-2，充分混匀，4℃保存备用，一周有效期。
2.dmem/fbs培养基：445mldmem，50mlfbs，5ml双抗，充分混匀，4℃保存备用。
3.wst-8溶液：1.8mg1-methoxypms，0.1158gwst-8，0.351gnacl，充分溶解于40ml超纯水中，0.45μm滤膜过滤，分装，-20℃避光保存备用。
4.peg/nacl溶液：peg6000200g，nacl146.1g，超纯水充分溶解，定容至1l，121℃灭菌20min，4℃保存备用。
5.tes溶液：0.146gedta(终浓度0.5mm)，171.15g蔗糖(终浓度0.5m)，tris-hcl(0.2m，ph8.0)充分溶解，定容至1l，0.22μm滤膜除菌，4℃保存备用。
实施例1人pd-1胞外段蛋白在真核细胞中的表达、纯化与鉴定
根据pd-1胞外段(pd-1ecd)基因序列(ncbigeneid:5133)并参考pcmv(购自上海碧云天生物技术有限公司)多克隆位点信息，设计合适的引物并加入nhei、bamhi酶切位点，以及6xhis标签，以pez-m02-pd-1(购自广州复能基因有限公司)作为模板，使用takara的primerstarhsdnapolymerase进行pcr反应，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验，在500bp上方有一清晰地扩增条带，与预期大小546bp相符。使用fermentas公司的fastdigestnhei和bamhi对pcmv载体和扩增出的pd-1ecd基因进行双酶切，插入pcmv质粒，构建编码pd-1ecd重组蛋白的真核表达载体pcmv-pd-1ecd。通过转染技术将pcmv-pd-1ecd导入hek293f细胞(购自thermofisher,usa)瞬时表达pd-1ecd重组蛋白，粗蛋白经过ni-nta亲和层析柱(购自gehealthcare,usa)纯化、浓缩后得到pd-1ecd重组蛋白。通过sec-hplc和elisa检测鉴定pd-1ecd重组蛋白纯度大于90％，且与鼠pd-1mab、pd-l1有结合活性，可作为抗原蛋白用于后续筛选纳米抗体工作。
实施例2pd-1纳米抗体筛选
1.vcsm13辅助噬菌体制备及滴度测定
取不同稀释度的vcsm13(购自agilenttechnologies)加入新扩增的e.colitg1(购自中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心)菌液中，室温孵育15min。混合物各添加3ml液化(低于50℃)的lbtopagar，混匀后倒入lb平板，37℃过夜培养，计算噬菌斑数并以获得单个噬菌斑。挑取单个噬菌斑至5ml新扩增的e.colitg1菌液，37℃振荡培养3h后，转移培养物至100ml2yt液体培养基中(含卡那霉素70μg/ml)，37℃振荡培养过夜。离心收集培养上清，70℃水浴后离心取上清，加入7％dmso，-20℃或-80℃保存。
2.大容量天然噬菌体纳米抗体文库扩增
取100μl大容量天然噬菌体纳米抗体文库(所用噬菌粒为pmecs，该纳米抗体文库已公开于yanj,wangp,zhum,lig,
3.大容量天然噬菌体纳米抗体文库淘洗
采用噬菌体展示技术筛选天然噬菌体库中(6.68×1011cfu/total)与pd-1胞外段特异性结合的噬菌体。
用100mmnahco3稀释pd-1ecd抗原(即实施例1制得的pd-1ecd重组蛋白，下同)至合适浓度，加入96孔酶标板内，包被4～6孔，于4℃过夜。次日以0.05％pbst洗板1次，2％脱脂牛奶室温封闭2h后，pbst洗板2次。取适量步骤2得到的噬菌体文库制备液，用pbs稀释噬菌体浓度至1×1012phage/ml，得到噬菌体文库稀释液。每孔加入100μl噬菌体文库稀释液，室温孵育1h后吸去噬菌体文库稀释液，pbst洗板5～20次(每轮淘洗按上轮淘洗结果调整洗板次数)。加入新鲜配制的100mm三乙胺溶液，室温静置10min后吸出洗脱液，加入1mtris-hcl中和，获得结合于固相的噬菌体抗体。取600μl噬菌体抗体加入2ml新扩增的e.colitg1菌液混匀，37℃静置，得到感染后菌液，取出适量测定cfu，感染后菌液中加入8ml2×yt/amp-glu培养基，37℃振荡培养后加入1ml辅助噬菌体vcsm13摇匀，室温静置30min。800×g离心10min，适量2×yt/amp-kan培养基重悬沉淀，37℃振荡培养过夜。第三天，回收培养液，peg沉淀噬菌体，1×pbs重悬后经0.22μm滤器过滤，用于后续的淘洗实验。最后一轮淘洗，4℃保存计算文库大小的平板(30＜单克隆＜300)或其上一稀释度平板备用。
4.pd-1胞外段噬菌体纳米抗体文库富集验证(噬菌体elisa法)
pd-1ecd以100ng/孔包被酶标板过夜，以100mmnahco3作为阴性对照，次日洗板1次，2％脱脂牛奶室温封闭2h后，pbst洗板2次。每轮淘洗制备的噬菌体库溶液用1×pbs稀释至2×1011phage/ml，与2％脱脂牛奶1:1混合，即为每轮的混合液。每轮的混合液以100μl/孔加入抗原孔及其对应无抗原孔，室温孵育1h。吸出混合液，弃入漂白液中，用pbst洗板5次后加入anti-m13bacteriophageantibody(hrp)(购自北京义翘神州生物科技公司)进行反应，室温静置1h。吸出抗体稀释液，洗板后加入tmb显色，硫酸终止，酶标仪测定od450nm。以od450nm(抗原孔-无抗原孔)作图，能看到每轮淘洗后吸光值逐渐加强，即针对抗原的噬菌体纳米抗体得到富集。结果显示，三轮淘洗后特异性结合pd-1ecd的噬菌体明显富集。
5.pd-1胞外段噬菌体纳米抗体文库筛选
96孔深孔板，每孔加入1mltb/amp培养基；每孔随机挑选加入步骤3中最后一轮保存平板上的一个单克隆。备lb/amp-glu平板，每个克隆对应一个区域，37℃过夜培养，4℃保存。接种后的96孔深孔板37℃振荡培养3h，加入iptg(终浓度1mm)，28℃振荡培养过夜，同时包被两块96孔板，同一酶标板上抗原孔与无抗原孔各半，4℃过夜。次日，0.05％pbst洗板1次，用2％脱脂牛奶室温封闭2h。96孔深孔板离心弃上清，tes重悬后，4℃振荡2h，再每孔加入300μltes/4，4℃振荡2h，离心取上清。96孔板吸去封闭液，用0.05％pbst洗板2次。深孔板上清加入包被pd-1ecd抗原的96孔板，100μl/孔，同时对应的无抗原孔也加入100μl/孔，室温孵育1h。吸出孵育液，pbst洗板，加入anti-6xhistagantibody(hrp)(购自abmart)进行反应，室温孵育1h；吸出抗体稀释液，洗板后加入tmb显色，酶标仪测定od450nm。吸光值大于1，且高于同一周质提取液无抗原孔两倍以上，认定为阳性克隆；经过elisa初步鉴定，共获得22个可能的阳性抗体克隆。阳性克隆在平板上对应区域菌体的接入5mllb/amp培养基中，37℃振荡培养至合适浓度。参照试剂盒说明，小量质粒抽提法制备pmecs-nbpd-1质粒，送检测序。
将22个阳性抗体克隆进行测序后得到的dna序列，用bioedit软件翻译获得氨基酸序列。根据国际免疫遗传学信息系统(imgt)对蛋白序列的框架区(frameworkregion，fr)和抗体识别区域(complementarity-determiningregions，cdr)进行区分，把cdr1、cdr2、cdr3序列均相同的克隆视为同一抗体株，cdr序列不同的克隆视为不同抗体株，最终共得到6个阳性抗体克隆(编号为nb1～6)，它们的cdr区氨基酸序列存在差异，其中2株纳米抗体的氨基酸序列特征见表1。
表1抗pd-1胞外段纳米抗体的一级结构序列特征
实施例3pd-1纳米抗体的表达纯化
1.e.coliwk6电转感受态制备
取-80℃保存的e.coliwk6(购自中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心)种子液接种扩增后，按1％(v/v)的比例接种至250mllb培养基中，37℃振荡培养至菌液od600＝0.35～0.4，冰浴30min。4℃离心，沉淀加入无菌超纯水重悬，重复离心一次，加入20ml冷10％无菌甘油溶液重悬菌体沉淀。4℃离心后，小心吸出上清，1ml冷10％无菌甘油溶液重悬菌体沉淀，分装到预冷的灭菌1.5mlep管中，-80℃保存备用。
2.pmecs-nbpd-1电转化
电转杯冰上预冷，取出步骤1制得的wk6感受态细胞，于冰上融化10min。取100ngpmecs-nbpd-1质粒储备液(即实施例1“5.pd-1胞外段噬菌体纳米抗体文库筛选”中得到的pmecs-nbpd-1质粒)，加入wk6感受态菌液中混匀，按照电转仪推荐的参数电转后，立即加入1mlsoc培养基混匀，吸出混合物，置于37℃振荡培养20min，加入1μlamp储备液，继续培养20min。取适量菌液涂布于lb/amp琼脂平板表面，37℃培养12h～16h，检测转染效率。次日，挑单克隆扩增冻存菌种。
3.pd-1纳米抗体wk6表达
将冻存的菌种接种到10mllb-amp培养基，于37℃振荡培养7h，作为细菌种子液。将细菌种子液按1％(v/v)的比例接种至tb/amp-glu-mg摇瓶培养基中，37℃，振荡培养至合适密度后，加入iptg(终浓度1mm)，28℃，200rpm培养过夜。次日，离心弃上清，用1×pbs洗涤菌体两遍后，菌体沉淀-20℃保存。
4.渗透压冲击法提取菌体周质空间总蛋白
步骤3得到的菌体室温解冻30min，tes重悬，4℃，200rpm振荡1～6h。再加入两倍tes体积的tes/4，继续4℃，200rpm振荡2h或过夜。11,300×g，4℃离心30min，取上清。加入0.2mmgcl2溶液，至终浓度为1mm，得到菌体周质空间总蛋白。
5.pd-1纳米抗体纯化
nisepharosetmexcel(购自gehealthcare)装柱，柱子规格为1.6×20cm，柱床体积为5ml。用1×pbs(ph7.4)平衡ni-nta亲和层析柱后，1ml/min上样(步骤4得到的菌体周质空间总蛋白)。1×pbs(ph7.4)复平衡后，用20mm咪唑洗脱蛋白，收集洗脱峰(pd-1纳米抗体)。通过15％sds-page蛋白电泳检测pd-1纳米抗体的分子量大小及纯度：sds-page电泳结果显示在18kda附近出现明显条带，与预期相符；westernblot的检验结果证明18kda附近出现的条带能与anti-hismab结合，nbpd-1具有his标签，证明nbpd-1被成功表达；说明收集的溶液中有目标蛋白的富集。sds-page电泳结果中6株nbpd-1纯化后样品泳道条带较单一，说明nbpd-1纯度较高；westernblot的检验结果中穿透峰样品均无出现条带，纯化平衡过程中无目的蛋白被洗脱下来；说明纯化效果较好。
6.pd-1纳米抗体浓缩
以millipore的amicon-ultra-15超滤管(mwco3kda)，1×pbs(ph7.4)作为洗涤缓冲液，4℃，4000rpm离心超滤，去除咪唑并浓缩至需要体积，0.22μm除菌后保存。
bca法测定抗体蛋白浓度，sds-page和westernblot验证纳米抗体表达，sec-hplc检测纳米抗体纯度。
2株nbpd-1工程菌产量及获得蛋白纯度如表2所示。
表2nbpd-1蛋白产量及纯度
由表2数据可知，2株nbpd-1工程菌产量超过3.6mg/l，纯度在93～97％之间。
7.nbpd-1理化性质预测
通过利用生物信息学网站expasy对纳米蛋白序列进行分子量、理论等电点(pi)和总平均亲水性(gravy)分析，其结果见表3所示。
表3nbpd-1ecd理化参数分析
由表3数据可知，nbpd-1分子量均约为18.3kda，说明所表达的这2株nbpd-1均为小分子量蛋白，符合纳米抗体分子量小的特点。理论等电点(pi)，nbpd-1理论等电点在pi为6.3左右。总平均亲水性(gravy)是指蛋白中所有氨基酸亲水值的平均值，通过对每个氨基酸进行记分而获得，亲水性最强的蛋白gravy为-4.5，疏水性最强的蛋白gravy为4.5。从疏水特性来看，当gravy为负值时判定为亲水性蛋白。由此可知6株nbpd-1均为亲水性蛋白质。
实施例4nbpd-1的理化性质
1.elisa法检测nbpd-1特异性
本实施例中使用的ctla4、cd4、cd8a、cd28和cd80均购自北京义翘神州生物科技公司。
本实施例中所涉及的pd-l1按如下方法制备得到：根据pd-l1基因序列(geneid:29126)，并参考pcmv(上海碧云天生物技术有限公司)多克隆位点信息，设计引物并引入nhei/xbai酶切位点，同时加入6xhis标签。以preceiver-m02-pd-l1(购自复能基因)作为模板，使用takara的primerstarhsdnapolymerase进行pcr反应，pcr产物1％琼脂糖凝胶电泳检验。使用fermentas公司的fastdigestnhei和xbai对pcmv载体和扩增出的pd-l1基因进行双酶切，插入pcmv质粒，构建编码pd-l1重组蛋白的真核表达载体pcmv-pd-l1。通过转染技术将pcmv-pd-l1导入hek293f细胞(thermofisher,usa)瞬时表达pd-l1重组蛋白，粗蛋白经过ni-nta亲和层析柱纯化、浓缩后得到pd-l1重组蛋白。
使用包被液将实施例1得到的pd-1ecd重组蛋白、pd-l1、enbrel(无关蛋白对照，购自pfizer,usa)、ctla4、cd4、cd8a、cd28和cd80分别配制成终浓度为1μg/ml溶液，以100μl/孔加入96孔酶标板内，于4℃包被过夜。次日，0.05％pbst洗板2次，5％脱脂牛奶37℃封闭2h。洗板2次后分别将浓度为600ng/ml的阳性对照pd-1mab(mouseanti-pd-1antibody，购自abcam)、空白对照pbs以及实施例2制得的pd-1纳米抗体(nb2、nb3)加入到96孔板内，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板3次后加入一抗(mouseanti-hatagantibody，购自abmart)进行反应，37℃孵育1h。洗板3次后加入二抗(goatanti-mouseiggmab，购自cellsignalingtechnology)，37℃孵育1h。洗板5次后加入tmb显色，硫酸终止，酶标仪测定od450nm和od630nm。
吸光值直观反映nbpd-1与pd-1的结合能力。nbpd-1和pd-1结合的吸光值与它们和对照抗原结合最高的吸光值相比，比值大于3的，定义该纳米抗体为阳性纳米抗体。结果显示，纳米抗体nb2和nb3与pd-1特异性结合能力较强，和其他7个对照抗原的结合能力较弱。
2.nbpd-1亲和常数测定
采用非竞争酶免疫法测定pd-1纳米抗体的亲和常数。
分别配制浓度为2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml的4种不同浓度的pd-1ecd的抗原溶液，以100μl/孔加入96孔酶标板内，于4℃包被过夜。次日洗板并封闭。将制备得到的pd-1纳米抗体度调节为1*10-6mol/l(nb2：18.398ug/ml，nb3：18.37669ug/ml)水平，3倍倍比稀释，空白对照为pbs，洗板2次后将样品加入到96孔酶标板内，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板3次后加入一抗(mouseanti-hatagantibody，购自abmart)进行反应，37℃孵育1h。洗板3次后加入二抗(goatanti-mouseiggmab，购自cellsignalingtechnology)，37℃孵育1h。洗板5次后加入tmb显色10min，加入2.29％硫酸终止，酶标仪测定od450nm和od630nm。拟合“s”型曲线，得出4个半数吸光值所对应的nbpd-1浓度(ec50)，结果如图2所示。
纳米抗体为单价抗体，按公式ka＝(n-1)/(nab'-ab)计算亲和常数(式中ab和ab'分别表示当抗原浓度为ag和ag'时，产生半数吸光值的抗体浓度(mol/l)，n＝ag/ag')，得6个ka值，计算平均值及标准差。结果如表4所示，可知，nb2和nb3亲和常数分别为(2.28±1.38)和(4.57±1.64)×107l/mol。
表4nbpd-1亲和力测定曲线模拟后求解得ka值
3.nbpd-1热稳定性
配制成终浓度为0.5μg/mlpd-1的包被液，以100μl/孔加入96孔酶标板内，于4℃包被过夜。次日，0.05％pbst洗板2次，5％bsa37℃封闭2h。封闭期间处理样品：将浓度为500ng/ml的阳性对照pd-1mab和nbpd-1分别置于25℃，37℃，60℃，90℃四种不同温度的下各0min、10min、30min、60min、120min以及180min。随后立即置于冰上。洗板2次后，将处理好的样品加入到96孔酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板5次后加入一抗(mouseanti-hatagantibody，购自abmart)进行反应(pd-1mab组加入pbs)，37℃孵育1h。洗板后加入二抗(goatanti-mouseiggmab，购自cellsignalingtechnology)反应，洗板后加入tmb显色，酶标仪测定od450nm和od630nm。
采用公式relativeactivity％＝ab'/ab×100％(式中ab和ab'分别表示样品处理前和处理后所产生的吸光值)计算热稳定相对活性，即热处理后抗体结合抗原的相对活性。
结果如图3所示，经过60℃处理后，pd-1mab相对活性随时间增加而显著下降，180min后相对活性接近0％，而nb2保持在80％以上，nb3保持在60％以上；经过90℃处理后，pd-1mab相对活性显著下降，处理10min后相对活性已降至0％，而nb2处理120min后相对活性才降至0％，nb3相对活性在处理60min后下降至0％；由此可见，本发明的nbpd-1相对于常用的鼠单克隆抗体，在高温处理时的稳定性更加好。
实施例5nbpd-1生物活性研究
1.蛋白标记hrp实验
取250μl要标记的蛋白液，加入25μl反应启动液，轻轻混匀。将混合液加入辣根过氧化酶瓶中混匀，置于37℃温箱2h。加入25μl终止剂混匀，置于室温1h。加入甘油(终浓度为50％)，-20℃保存备用。
2.nbpd-1的竞争实验
2.1nbpd-1与pd-1mab的竞争结合实验
配制成终浓度为0.5μg/mlpd-1的包被液，以100μl/孔加入96孔酶标板内，于4℃包被过夜。次日，0.05％pbst洗板2次，5％脱脂牛奶37℃封闭2h。以稀释32000倍的鼠pd-1mab梯度稀释nbpd-1，同时以一株针对兔igg的纳米抗体(美国abcam公司ab218695)作为阴性对照(control)，平行操作，纳米抗体最大浓度为100μg/ml，稀释11个梯度，洗板2次后加入到96孔酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板5次后加入二抗(goatanti-mouseiggmab，购自cellsignalingtechnology)，37℃孵育1h。洗板5次后加入tmb显色，酶标仪测定od450nm和od630nm。
nb2和nb3对稀释32000倍的pd-1mab与0.5μg/mlpd-1的半数有效抑制浓度分别0.55831μg/ml、0.20549μg/ml。由图4可知，随着nbpd-1浓度增加，pd-1mab与pd-1的结合力呈现出递减的趋势，说明这nb3(nb2)与pd-1的结合表位同pd-1mab与pd-1表位重叠或相近，或者是nb3与pd-1的亲和力高于pd-1mab与pd-1之间的亲和力。同时，结果显示nb2和nb3结合pd-1的区域可能不同，或者nb3与pd-1亲和力可能低于pd-1mab与pd-1亲和力。
2.2nbpd-1与pd-l1的竞争结合实验
配制成终浓度为0.5μg/mlpd-1的包被液，以100μl/孔加入96孔酶标板内，于4℃包被过夜。次日，0.05％pbst洗板2次，5％bsa封闭2h。以2.5μg/ml的pd-l1-hrp稀释nbpd-1(0～20μg/ml)成相应浓度，洗板2次后加入到96孔酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h；以纳米抗体ab218695作为阴性对照组(control)，平行操作。洗板5次后加入二抗(goatanti-mouseiggmab，购自cellsignalingtechnology)，37℃孵育1h。洗板5次后加入tmb显色10min，加入2.29％硫酸终止，酶标仪测定od450nm和od630nm。
由图5可知，随着nb2或nb3浓度增加，pd-l1与pd-1的结合力呈现出递减的趋势，说明这两株纳米抗体与pd-1的结合表位同pd-l1与pd-1表位重叠或相近，或者nb2、nb3与pd-1的亲和力高于pd-l1，能将结合在pd-1表面的pd-l1竞争下来，即nb2或nb3能有效阻断pd-l1与pd-1的结合。
3.pcdh-cmv-mcs-ef1-puro-pd-1重组质粒构建
根据pd-1基因序列并参考pcdh-cmv-mcs-ef1-puro(购自systembiosciences,usa)多克隆位点信息，设计引物并加入xbai/bamhi酶切位点，用以克隆pd-1胞外段基因序列；通过pcr扩增pd-1基因片段；xbai、bamhi双酶切pd-1基因片段及pcdh-cmv-mcs-ef1-puro；随后连接、转化；筛选阳性克隆，测序验证，最后重组质粒大量抽提，得到含pd-1的重组质粒。
4.慢病毒载体介导pd-1基因转染hek293t细胞及稳定株筛选
用dmem/fbs培养基于37℃、5％co2培养箱内培养hek293t细胞(购自thermofisher,usa)，待细胞密度达70％～80％时，换无血清dmem培养基。将1.5mlopti-mem、各dna溶液(7.5μgpspax2、5μg慢病毒包装质粒pmd2.g(购自addgene,usa)和10μg含pd-1的重组质粒充分混合，室温静置5min。
dna/pei混合液：另一ep管加入1.5mlopti-mem及112.5μgpei，充分混合后加入混合液1中混匀，室温静置15min。将dna/pei混合液均匀滴加至细胞密度为70～80％的处于对数生长期的hek293t细胞。37℃培养12h后，更换为10mldmem/fbs培养基，继续培养，48h后离心收集hek293t细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤，常规peg沉淀病毒颗粒。dmem/fbs培养基重悬病毒颗粒加入处于对数生长期的hek293t细胞中，37℃，5％co2，培养48h。离心换液，加入含10μg/ml嘌呤霉素的dmem/fbs培养基培养。视细胞密度换液或传代，至获得稳定的hek293t/pd-1细胞株。westernblot鉴定hek293t/pd-1细胞，对照组hek293t没有出现条带，即hek293t本身不表达pd-1，而筛选出的hek293t/pd-1细胞出现特异性条带，即hek293t/pd-1表达pd-1。
5.激光共聚焦鉴定hek293t/pd-1细胞
取对数生长期的hek293t/pd-1和hek293t细胞，经0.25％胰酶消化，吹打重悬至单细胞悬液，稀释浓度至2×105cells/ml。加入共聚焦专用小皿，培养至细胞密度合适。1×pbs清洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min。1×pbs清洗2遍后加入1％bsa重悬，37℃封闭1h。1×pbs清洗后孵育抗体(mouseanti-pd-1antibody(pe)，购自bd公司)，37℃避光孵育1h。pbst清洗3遍，加入dapi溶液孵育15min。pbst清洗3遍加入抗荧光猝灭剂。共聚焦荧光显微镜检测hek293t细胞膜上pd-1表达情况。共聚焦结果显示，相比于对照组hek293t，hek293t/pd-1在细胞膜位置出现明显荧光，hek293t/pd-1细胞膜有pd-1分子；说明hek293t/pd-1稳定细胞株筛选成功。
6.流式验证nbpd-1与hek293t/pd-1细胞膜上pd-1分子结合
以稳定表达pd-1分子的hek293t/pd-1细胞为实验材料分析本发明的nbpd-1与细胞膜表面pd-1分子的结合情况，以分析本发明的纳米抗体与天然表达的pd-1分子特异性识别活性。
取对数生长期的hek293t/pd-1和hek293t细胞，经0.25％胰酶消化，吹打重悬成单细胞悬液。取5×106cells/管，1×pbs清洗1遍。各组hek293t/pd-1孵育抗体顺序为：pd-1mab组：mouseanti-pd-1antibody+goatanti-mouseigg-fitc；nb2组：(nb2+mouseanti-hisantibody)+goatanti-mouseigg-fitc；nb3组：(nb3+mouseanti-hisantibody)+goatanti-mouseigg-fitc。对照组：hek293t细胞+1％bsa+goatanti-mouseigg(fitc)1×pbs清洗2遍后加入4％多聚甲醛固定15min。1×pbs清洗3遍后加入1％bsa重悬，37℃封闭1h。1×pbs清洗后按上述分组孵育蛋白/抗体，37℃避光孵育1h。孵育荧光抗体(goatanti-mouseigg-fitc)，加入100μl抗体稀释液重悬，37℃孵育避光1h。pbst清洗3遍，1×pbs重悬，流式细胞仪检测。
结果如图6所示，从a、b、c可看出，pd-1mab、nb2、nb3均能识别天然构象pd-1。nb2和nb3组mean值分别为50.7、46.9，与pd-1mab组mean值44.8基本相同，pd-1mab组median值(36.8)、nb2组median值(36.5)和nb3组median值(37.5)也基本一致(图6中的d进一步将a、b、c中的pd-1mab、nb2、nb3数据进行叠加比对呈现)，即表明nb2和nb3具有与鼠pd-1mab相同的、识别细胞表面pd-1的能力，说明nbpd-1中nb2和nb3能特异性结合细胞膜表面pd-1分子。
7.pha体外激活pbmc模型研究nbpd-1功能
利用pha(植物血凝素)体外激活t细胞，以ifn-γ浓度检测t细胞活化情况，研究该体系中nbpd-1对pd-l1抑制t细胞活性的阻断效果。
取1名健康志愿者全血10～15ml，利用人淋巴细胞分离液分离人pbmc细胞。平衡液清洗两遍，rpmi1640/fbs培养基重悬细胞并计数，以5×104/孔接种于96孔板，每孔50μl。将梯度的pha以25μl/孔加入对应培养孔，至终浓度分别为0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。同时在培养体系中以25μl/孔加入梯度稀释好的pd-l1至终浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml置于37℃细胞培养箱培养72h。300×g离心10min收获上清，利用人ifn-γelisa检测试剂盒(购自联科生物)测定上清中ifn-γ的表达情况，最终选择5μg/mlpha为刺激浓度，10μg/mlpd-l1为抑制浓度，进行nbpd-1活性评价实验。
同样的方法分离人pbmc细胞并以同样的细胞密度接种于96孔板中。配置最适pha刺激浓度(5μg/ml)以及pd-l1抑制浓度(10μg/ml)加入相应的孔中。rpmi1640/fbs培养基稀释抗体nbpd-1至终浓度为0μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml加入对应的反应体系，37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人ifn-γelisa检测试剂盒测定上清中ifn-γ的表达情况。取3名健康志愿者全血分别重复实验，统计数据。
结果如图7所示，在以上抑制体系中，分别添加nb2或nb3后ifn-γ浓度都有所回升，且在一定nbpd-1浓度下，ifn-γ浓度随着nbpd-1浓度升高而升高。说明在一定条件下，两株nbpd-1都能够逆转活化t细胞被pd-l1抑制的状态，进而上调ifn-γ的表达。同时，在nb2浓度为2.5μg/ml时(pha+pd-l1+nb2组)，ifn-γ浓度最高；在nb3浓度为5μg/ml时(pha+pd-l1+nb3组)，ifn-γ浓度最高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
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<120>一种pd-1纳米抗体及其克隆表达方法与应用
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