本发明涉及一种杏鲍菇多糖的提纯方法，属于食品、医药领域，也可以归入食用菌深加工技术领域。
背景技术：
杏鲍菇（Pleurotus eryngii Quel）别名剌芹侧耳，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年开发栽培比较成功的珍稀食用菌新品种。目前，国内杏鲍菇的生产发展十分迅速，已从季节性栽培向工厂化栽培转变。杏鲍菇栽培和加工过程会产生大量的副产物（如畸形菇、菇脚等），其产量可达总生物量的20%以上，可为杏鲍菇多糖的制备提供充足的原料，具有良好的开发前景。另一方面，大量研究表明，杏鲍菇多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、降血脂、降血脂、降胆固醇、抗疲劳、抗衰老等多种生物活性，具有较高的开发利用价值。杏鲍菇多糖含有20%左右的蛋白质，其分子量主要分布在32K道尔顿区间，大约由142个葡萄糖和58个氨基酸结构单元通过化学键连接而成。
粗多糖通常需要进一步提纯后使用。其中，脱除蛋白质杂质是多糖提纯的一个重要步骤。大量科学研究表明，无论是从植物中提取的粗多糖，还是微生物分泌的胞外多糖，几乎都含有蛋白质和其他小分子物质（无机盐、单糖、色素、脂肪等）杂质。其中，蛋白质含量较高，它不仅和多糖性质相近，而且还和多糖以蛋白聚糖的形式结合，因此采用一般的提纯方法难以将它们完全分开。评判一种多糖提纯方法的好坏，通常以蛋白质去除率和多糖损失率为标准。
目前，科研人员已经开发出来了多种多糖去蛋白的方法，如sevag法（即：氯仿-正丁醇法）、三氯乙酸法、等电点法、酒精变性法、大孔树脂吸附法、层析法、蛋白酶水解法、联用法等等。尽管如此，这些方法依然不够完美，需要进一步完善。其中，Sevag 法和乙醇变性法中使用了大量挥发性有机溶剂，溶剂回收比较困难，并且有燃烧和爆炸的风险；三氯乙酸法和等电点法在去除蛋白质同时去除了大量蛋白聚糖，造成多糖得率降低，而且产生大量酸性废水；大孔树脂吸附法和层析法难以工业化生产。游离蛋白酶直接水解法固然简单，但由于蛋白酶本身就是蛋白质，加入游离蛋白酶就必然会给多糖带入新的蛋白质杂质，使多糖中的蛋白质杂质不能完全去除。相反，本发明采用固定化蛋白酶水解，既可以达到酶解多糖中蛋白质杂质的目的，又不会给多糖带入新的蛋白质杂质，是一种更为理想的去除多糖中蛋白质杂质的方法。由于固定化蛋白酶不溶于水，酶解结束后，只需简单过滤就可以将其从溶液中彻底分离出来，无需像使用游离蛋白酶那样进行灭酶操作。另外，固定化蛋白酶可重复使用，使用成本更低。当然，固定化蛋白酶和非固定化的游离蛋白酶相比也有缺点。固定化过程往往会造成酶的部分失活，酶活力下降。因此，若要完成同样的酶解工作，固定化蛋白酶的添加浓度比非固定化酶更大，酶解速率偏低。另一方面，由于不同种类蛋白酶的酶切位置不同，所以采用单一蛋白酶往往无法获得较高的水解度，实践中往往采用多种蛋白酶组合水解蛋白质。
透析和超滤都是借助半透膜孔径大小对不同分子量物质进行机械筛分的。透析膜是一种扩散膜，而超滤膜是一种压力活性膜。透析法仅需借助半透膜袋就可操作，而超滤法则需要借助超滤装置。透析法虽然比超滤法简单，但是其处理样品体积较小，而且非常耗时，因而仅适合在实验室内使用。超滤法方便快捷，处理量可大可小，在实验室和生产上都已得到广泛应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术不足，是要提供一种改进的杏鲍菇多糖提纯方法。本发明的方法可将杏鲍菇水提物中的蛋白质含量从25%左右降低到3%以下，同时还去除了大量单糖、低聚糖、氨基酸以及小肽等低分子量杂质，杏鲍菇多糖纯度从45%提纯到90%以上。
为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
一种杏鲍菇多糖的提纯方法，首先利用两种以上固定化蛋白酶组合水解杏鲍菇水提物，将水提物中的大分子蛋白质组分水解成小分子的肽或氨基酸，然后通过透析或超滤装置处理，弃去透过液（组分包括：小分子的肽、氨基酸、单糖、低聚糖等），收集并干燥截留液（以大分子的多糖为主要组分），最终获得提纯的杏鲍菇多糖粉末，具体包括以下步骤：
（1）杏鲍菇粗多糖的提取
将新鲜杏鲍菇烘干，磨成20～200目粉末，以1: 10～1:40固液比加水煮沸1～4h，冷却后5000～10000 r/min离心2～10 min，去除固体残渣，获得澄清的杏鲍菇水提液；
（2）固定化蛋白酶的制备
采用戊二醛交联法将不同种类的蛋白酶分别固定到甲壳素上，制得两种以上的固定化蛋白酶；所述的蛋白酶包括碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶；
（3） 固定蛋白酶组合酶解
使用1 mol/L NaOH或HCL溶液，调节步骤（1）得到的杏鲍菇水提液的酸碱度，至固定化蛋白酶的最适酶解pH值；将步骤（2）制得的一种固定化蛋白酶的固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，45～55℃酶解1h，期间不断地滴加1 mol/L NaOH溶液，以保持溶液pH值不变；酶解结束后，过滤去除固定化蛋白酶固体颗粒；接着，将所得酶解液的pH值调节到另一种固定化蛋白酶的适宜酶解数值，以1%（W/V）浓度将该固定化蛋白酶固体颗粒加入到酶解液中，45～55℃酶解1h，期间不断地滴加1 mol/L NaOH溶液，以保持溶液pH值不变；酶解结束后，过滤去除固定化蛋白酶固体颗粒；重复操作，直至将固定化蛋白酶都添加到酶解液中进行酶解；
（5）透析或超滤
将步骤（4）经过固定化酶酶解后的杏鲍菇水提液装入透析袋，放入10倍体积的纯净水透析，4h换水一次，共透析4次以上；或采用超滤方法进行处理，体积小的样品溶液可采用超滤离心管处理，体积大的样品溶液则可采用平板或管式超滤膜组件处理；所述透析和超滤的截留分子量为2000道尔顿；
（6）干燥
将步骤（5）透析或超滤后的提取液经过干燥处理，即获得提纯的杏鲍菇多糖粉末；干燥处理可采用冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、热风干燥等多种方式；干燥之前可将溶液加热浓缩，以提高干燥效率。
本发明主要针对游离蛋白酶去蛋白方法的缺陷（即：水解结束时，添加到反应体系的游离蛋白酶难以去除，会给多糖成品带来新的蛋白质杂质，去蛋白效果不够理想）。相反，若利用固定化蛋白酶不溶于水的特点，将固定化蛋白酶替代游离蛋白酶，加入到提取液中酶解，水解结束时，只需简单过滤就可以将所加入的固定化蛋白酶分离，这样就不会给提纯后的多糖带入新的蛋白质杂质。通过多种固定化蛋白酶组合酶解，可将粗多糖中的大分子蛋白质酶解为小分子的肽和氨基酸，通过透析或超滤将小分子杂质和大分子多糖分离，最后得到纯度较高的杏鲍菇多糖。
本发明的有益效果在于：
1、去除粗多糖中的蛋白质杂质效果好；采用固定化蛋白酶法替代目前普遍采用的游离蛋白酶法，简便易行，多糖得率和纯度都大程度提高；此外，使用固定化蛋白酶和游离蛋白酶法相比，无需进行灭酶操作，可重复使用，使用成本更低；
2、不使用有机溶剂、不产生大量的强酸；具有经济、无毒无害、不会燃烧爆炸的优点；
3、容易应用于规模化生产；由于固定化酶技术和超滤技术已在生产上广泛应用，它比大孔树脂吸附法和层析法等实验室方法更容易实现产业化；
4、提纯后的杏鲍菇多糖制品的品质更好；采用本发明所述的多糖提纯技术后，杏鲍菇多糖制品不仅纯度高，而且色泽纯白、无色无味，具有更为广泛的应用范围。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
（1）杏鲍菇粗多糖的提取
将新鲜杏鲍菇子实体切成1cm薄片，100℃烘干30min，冷却后，倒入到中药粉碎机内，磨成20目粉末。将杏鲍菇粉装入锅中，以1:20固液比加水煮沸1h。冷却后，将含渣提取液分装入离心管，8000 r/min离心2 min，去除固体残渣，获得澄清的杏鲍菇水提液。
（2）固定化蛋白酶的制备
取100ml烧杯1个，称取2g壳聚糖粉末，加入20 ml 1%（v/v）戊二醛溶液，放入磁力搅拌子，置于水浴磁力搅拌器内30℃搅拌2h，过滤除去戊二醛溶液，将戊二醛活化后的壳聚糖与5ml碱性蛋白酶溶液（总的酶活力为2000U）混合，30℃水浴搅拌6h，过滤去除未偶联的碱性蛋白酶，使用20ml超纯水洗涤固定化的碱性蛋白酶2次，将固定化碱性蛋白酶滤干备用。接着采用类似方法制备得到固定化复合风味蛋白酶。
（3） 固定蛋白酶组合酶解
使用1 mol/L NaOH溶液调节上述杏鲍菇水提液的pH值至8.5，将固定化的碱性蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，50℃酶解1h，酶解期间不断地滴加1 mol/L NaOH溶液，维持酶解液的pH值不变，酶解结束后，过滤去除固定化蛋白酶固体颗粒。而后，调节上述酶解液的pH值到7，再将固定化的复合风味蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，45℃酶解1h。酶解期间，不断地滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH=7.0不变。酶解结束后，滤除固定化的风味蛋白酶固体颗粒。
（5）透析
将上述经过固定化酶酶解后的杏鲍菇水提液装入透析袋，透析夹子封口后，放入10倍体积的纯净水透析，4h换水一次，共透析4次。
（6）浓缩、冷冻干燥
取上述透析后的提取液，倒入烧杯，置于电炉上蒸发浓缩，至固形物含量为2%时，冷却后倒入冷冻干燥专用盘子，送入-40 ℃冰箱冷冻4h，而后放入冷冻干燥机干燥24h，即可获得提纯的杏鲍菇多糖粉末。
采用此法能够将杏鲍菇水提物中的蛋白质含量从25%左右降低到2.5%，同时还去除了大量单糖、低聚糖、氨基酸以及小肽等低分子量杂质，杏鲍菇多糖纯度从45%提纯到95%。
实施例2
（1）杏鲍菇粗多糖的提取
将新鲜杏鲍菇菇头（即：杏鲍菇和培养料的结合部分）切成1cm薄片，100℃烘干30min，冷却后，倒入到中药粉碎机内，磨成100目粉末。将杏鲍菇粉装入锅中，以1:10固液比加水煮沸1h。冷却后，将含渣提取液分装入离心管，6000 r/min离心5 min，去除固体残渣，获得澄清的杏鲍菇水提液。
（2）固定化蛋白酶的制备
取100ml烧杯1个，称取2g壳聚糖粉末，加入20 ml 1%（v/v）戊二醛溶液，放入磁力搅拌子，置于水浴磁力搅拌器内，30℃保温搅拌2h，过滤除去戊二醛溶液，将戊二醛活化后的壳聚糖与5ml中性蛋白酶溶液（总的酶活力为2000U）混合，30℃水浴搅拌6h，过滤去除未偶联的碱性蛋白酶，使用20ml超纯水洗涤固定化的碱性蛋白酶2次，将固定化碱性蛋白酶滤干备用，采用类似方法制备得到固定化木瓜蛋白酶。
（3） 固定蛋白酶组合酶解
使用1 mol/L NaOH溶液调节上述杏鲍菇水提液的pH值至7，将固定化的中性蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，55℃酶解1h，酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH值不变，酶解结束后，过滤去除固定化蛋白酶固体颗粒。而后，再将固定化的木瓜蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，55℃酶解1h，酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH值不变，酶解结束后，过滤去除固定化的木瓜蛋白酶颗粒。
（5）超滤
将上述固定化酶酶解液装入10ml超滤离心管，旋上离心管盖子，放入冷冻离心机，6000 r/min离心5 min，得超滤截留液2ml。补充超纯水到超滤截留管内，使管内溶液体积为10ml，旋上离心管盖子，放入冷冻离心机，6000 r/min离心5 min。重复操作，共4次。
（6）浓缩、冷冻干燥
将上述超滤浓缩后的溶液装入冷冻干燥机专用的盘子，送入-40 ℃冰箱冷冻4h，而后放入冷冻干燥机干燥，即可获得提纯的杏鲍菇多糖粉末。
采用此法能够将杏鲍菇水提物中的蛋白质含量从25%左右降低到3%，同时还去除了大量单糖、低聚糖、氨基酸以及小肽等低分子量杂质，杏鲍菇多糖纯度从45%提纯到92%。
实施例3
（1）杏鲍菇粗多糖的提取
将新鲜的杏鲍菇等外品切成1cm薄片，100℃烘干30min，冷却后，倒入到中药粉碎机内，磨成20目粉末。将杏鲍菇粉装入锅中，以1:30固液比加水煮沸1h。冷却后，将含渣提取液分装入离心管，5000 r/min离心10 min，去除固体残渣，获得澄清的杏鲍菇水提液。
（2）固定化蛋白酶的制备
取100ml烧杯1个，称取2g壳聚糖粉末，加入20 ml 1%（v/v）戊二醛溶液，放入磁力搅拌子，置于水浴磁力搅拌器内30℃搅拌2h，过滤除去戊二醛溶液，将戊二醛活化后的壳聚糖与5ml胰蛋白酶溶液（总的酶活力为2000U）混合，30℃水浴搅拌6h，过滤去除未偶联的胰蛋白酶，使用20ml超纯水洗涤固定化的胰蛋白酶2次，将固定化胰蛋白酶滤干备用，接着采用类似方法制备得到固定化胃蛋白酶。
（3） 固定蛋白酶组合酶解
使用1 mol/L NaOH溶液调节上述杏鲍菇水提液的pH值至7.0，将固定化的胰蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，37℃酶解1h，酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH=7.0不变。酶解结束后，过滤去除固定化蛋白酶固体颗粒。而后，使用1 mol/L HCL溶液调节上述酶解液的pH值到2.0，再将固定化的胃蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，37℃酶解1h，过滤去除固定化的蛋白酶固体颗粒。酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH=2.0不变。
（5）超滤
取上述经过固定化酶酶解后的杏鲍菇水提液，利用美国密理博（Millipore）平板超滤膜装置将溶液浓缩到原体积的1/5，加入纯净水到浓缩液中至原体积，再用平板超滤膜装置浓缩到原体积的1/5，共重复操作4次。
（6）喷雾干燥
将上述超滤浓缩液进行喷雾干燥，即可获得提纯的杏鲍菇多糖粉末。
采用此法能够将杏鲍菇水提物中的蛋白质含量从25%左右降低到3%以下，同时还去除了大量单糖、低聚糖、氨基酸以及小肽等低分子量杂质，杏鲍菇多糖纯度从45%提纯到91%。
实施例4
（1）杏鲍菇粗多糖的提取
将新鲜的杏鲍菇等外品切成1cm薄片，105℃烘干30min，冷却后，倒入到中药粉碎机内，磨成200目粉末。将杏鲍菇粉装入锅中，以1:30固液比加水煮沸1h。冷却后，将含渣提取液分装入离心管，5000 r/min离心10 min，去除固体残渣，获得澄清的杏鲍菇水提液。
（2）固定化蛋白酶的制备
取100ml烧杯1个，称取2g壳聚糖粉末，加入20 ml 1%（v/v）戊二醛溶液，放入磁力搅拌子，置于水浴磁力搅拌器内30℃搅拌2h，过滤除去戊二醛溶液，将戊二醛活化后的壳聚糖与5ml菠萝蛋白酶溶液（总的酶活力为2000U）混合，30℃水浴搅拌6h，过滤去除未偶联的蛋白酶，使用20ml超纯水洗涤固定化的菠萝蛋白酶2次，将固定化菠萝蛋白酶滤干备用，接着采用类似方法制备得到固定化无花果蛋白酶和固定化酸性蛋白酶。
（3） 固定蛋白酶组合酶解
使用1 mol/L NaOH溶液调节上述杏鲍菇水提液的pH值至7.0，将固定化的菠萝蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，37℃酶解1h，酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH=7.0不变。酶解结束后，过滤去除固定化蛋白酶固体颗粒。之后，使用1 mol/L HCL溶液调节上述酶解液的pH值到5.0，将固定化无花果蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，37℃酶解1h，过滤去除固定化的蛋白酶固体颗粒。酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH=5.0不变。 最后，使用1 mol/L HCL溶液调节上述酶解液的pH值到3.0，将固定化酸性蛋白酶固体颗粒以1%（W/V）浓度加入到杏鲍菇水提液中，37℃酶解1h，过滤去除固定化的蛋白酶固体颗粒。酶解期间滴加1 mol/L NaOH溶液，保持pH=3.0不变。
（5）超滤
取上述经过固定化酶酶解后的杏鲍菇水提液，利用美国密理博（Millipore）平板超滤膜装置将溶液浓缩到原体积的1/5，加入纯净水到浓缩液中至原体积，再用平板超滤膜装置浓缩到原体积的1/5，共重复操作4次。
（6）喷雾干燥
将上述超滤浓缩液进行喷雾干燥，即可获得提纯的杏鲍菇多糖粉末。
采用此法能够将杏鲍菇水提物中的蛋白质含量从25%左右降低到3%以下，同时还去除了大量单糖、低聚糖、氨基酸以及小肽等低分子量杂质，杏鲍菇多糖纯度从45%提纯到95%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。