本发明涉及医学生物
技术领域：
，具体而言，涉及miRNA在制备检测心脏病试剂、试剂盒中的应用及检测试剂、检测试剂盒。
背景技术：
：目前，心血管疾病是导致人类死亡的第一杀手，心力衰竭是心血管疾病中的一种，心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段，但近几年心力衰竭群体年轻化趋势十分明显，但并没有引起年轻一族的足够重视。如何有效诊断和预防心力衰竭目前医学和生物学研究亟待解决的问题。微小RNA(microRNA，miR)是一类广泛存在于真核生物、长度为21-25nt的非蛋白质编码小RNA，它们能以序列特异性方式调节基因表达，在发育、凋亡、代谢以及人类疾病方面都起着不容忽视的作用。miR的生理病理调控机制是近几年来受到高度重视的一门新型学科。近年来的研究表明，心血管疾病会导致体内特殊的微小RNA的表达量发生明显的变化，因此，通过检测体液中的特定微小RNA的变化即可起到诊断、预防心血管疾病的作用。但是，目前对心力衰竭的相关特定微小RNA的研究尚存在不足。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断心脏疾病的产品中的应用：(a)miR-155-5p；(b)miR-216a-5p；(c)miR-217F-5p；以缓解现有技术中存在的对心脏疾病相关的特定miR研究尚有不足的技术问题。本发明的第二目的在于提供一种用于诊断心脏疾病的试剂。本发明的第三目的在于提供一种用于诊断心脏疾病的试剂盒。为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断心脏疾病的产品中的应用：(a)miR-155-5p；(b)miR-216a-5p；(c)miR-217F-5p。一种用于诊断心脏疾病的试剂，试剂包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质：(A)用于检测miR-155-5p的引物；(B)用于检测miR-216a-5p的引物；(C)用于检测miR-217F-5p的引物。一种用于诊断心脏疾病的试剂盒，试剂盒包括上述的用于诊断心脏疾病的试剂。与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过开发新型的miRNA包括miR-155-5p、miR-216a-5p或miR-217F-5p，发现在患有心脏疾病的心肌细胞中表达显著上升，因此本发明中提供的miR-155-5p、miR-216a-5p或miR-217F-5p可以作为心脏相关疾病的风险预估与检测，另外，本发明还提供了miR-155-5p、miR-216a-5p或miR-217F-5p的检测试剂和检测试剂盒，借助于实时定量PCR的技术来统计微小RNA变化，具有分析样本需要量小、自动化程度高、避免污染等优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实验例提供的miR-155-5p荧光定量实验图；图2为本发明实验例提供的miR-216a-5p荧光定量实验图；图3为本发明实验例提供的miR-217F-5p荧光定量实验图；图4为本发明实验提供的miR-155-5p的ROC曲线图；图5为本发明实验例提供的miR-216a-5p的ROC曲线图；图6为本发明实验例提供的miR-217F-5p的ROC曲线图；图7为本发明实验例提供的miR-155-5p与miR-216a-5p相关性结果图；图8为本发明实验例提供的miR-155-5p与miR-217F-5p相关性结果图；图9为本发明实验例提供的miR-216a-5p与miR-217F-5p相关性结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的miRNA在制备检测心脏病试剂、试剂盒中的应用及检测试剂、检测试剂盒进行具体说明。如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断心脏疾病的产品中的应用：(a)miR-155-5p；(b)miR-216a-5p；(c)miR-217F-5p。进一步地，在本发明较佳的实施例中，miR-155-5p的碱基序列如SEQIDNO.1所示，miR-216a-5p的碱基序列如SEQIDNO.2所示，miR-217F-5p的碱基序列如SEQIDNO.3所示。进一步地，在本发明较佳的实施例中，产品为检测心脏病的检测试剂或检测试剂盒。进一步地，在本发明较佳的实施例中，心脏疾病为心力衰竭。一种用于诊断心脏疾病的试剂，试剂包括如下(A)-(C)任意一种或多种物质：(A)用于检测miR-155-5p的第一引物序列；(B)用于检测miR-216a-5p的第二引物序列；(C)用于检测miR-217F-5p的第三引物序列。进一步地，在本发明较佳的实施例中，用于检测miR-155-5p的第一引物序列的碱基序列如SEQIDNo.4所示；用于检测miR-216a-5p的第二引物序列的碱基序列如SEQIDNo.5所示；用于检测miR-217F-5p的第三引物序列的碱基序列如SEQIDNo.6所示。一种用于诊断心脏疾病的试剂盒，试剂盒包括上述的用于诊断心脏疾病的试剂进一步地，在本发明较佳的实施例中，心脏疾病为心力衰竭，还包括核酸提取试剂和核酸检测试剂。进一步地，在本发明较佳的实施例中，核酸提取试剂包括Trizol试剂。进一步地，在本发明较佳的实施例中，核酸检测试剂为PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs中的至少一种以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供如下(a)-(c)任意一种或多种物质在制备用于诊断心脏疾病的产品中的应用：(a)miR-155-5p；(b)miR-216a-5p；(c)miR-217F-5p。miR-155-5p的碱基序列如SEQIDNO.1所示，miR-216a-5p的碱基序列如SEQIDNO.2所示，miR-217F-5p的碱基序列如SEQIDNO.3所示。miR-155-5p的核苷酸序列为：uuaaugcuaaucgugauaggggu(SEQIDNo.1)，miR-216a-5p的核苷酸序列为uaaucucagcuggcaacuguga(SEQIDNo.2)，miR-217F-5p的核苷酸序列为uacugcaucaggaacugauugga(SEQIDNo.3)。可以将miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p应用到心脏疾病尤其是心力衰竭；可以将miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p应用到检测心脏疾病的试剂或试剂盒中。实施例2本实施例提供一种用于诊断心脏疾病的试剂。诊断心脏疾病的试剂包括miR-155-5p，miR-155-5p的碱基序列如SEQIDNO.1所示。以及检测miR-155-5p的第一引物序列，第一引物序列的碱基序列如SEQIDNo.4所示；对应的下游引物序列来自TaKaRa试剂盒Mir-XMIranFirst-StrandSynthesisKitCat#638313。实施例3本实施例提供一种用于诊断心脏疾病的试剂。诊断心脏疾病的试剂包括miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p；miR-155-5p的碱基序列如SEQIDNO.1所示，miR-216a-5p的碱基序列如SEQIDNO.2所示，miR-217F-5p的碱基序列如SEQIDNO.3所示。以及用于检测miR-216a-5p的所述第二引物序列的碱基序列如SEQIDNo.5所示；所述用于检测miR-217F-5p的所述第三引物序列的碱基序列如SEQIDNo.6所示；对应第一引物序列、第二引物序列和第三引物序列的下游引物来自于TaKaRa试剂盒Mir-XMIranFirst-StrandSynthesisKitCat#638313。实施例4本实施例提供一种用于诊断心脏疾病的试剂盒，试剂盒包括miR-155-5p，miR-155-5p的碱基序列如SEQIDNO.1所示。以及检测miR-155-5p的第一引物序列，第一引物序列的碱基序列如SEQIDNo.4所示，对应第一引物序列、第二引物序列和第三引物序列的下游引物来自于TaKaRa试剂盒Mir-XMIranFirst-StrandSynthesisKitCat#638313。试剂盒还包括提取核酸的试剂，比如提取样本中总RNA的Trizol试剂，以及核酸检测试剂，比如PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。实施例5本实施例提供一种用于诊断心脏疾病的试剂盒，试剂盒包括miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p；miR-155-5p的碱基序列如SEQIDNO.1所示，miR-216a-5p的碱基序列如SEQIDNO.2所示，miR-217F-5p的碱基序列如SEQIDNO.3所示。以及检测miR-155-5p的第一引物序列，第一引物序列的碱基序列如SEQIDNo.4所示；检测miR-216a-5p的第二引物序列，第二引物序列的碱基序列如SEQIDNo.5所示；检测miR-217F-5p的第三引物序列，第三引物序列的碱基序列如SEQIDNo.6所示。与第一引物序列、第二引物序列和第三引物序列对应的下游引物来自于TaKaRa试剂盒Mir-XMIranFirst-StrandSynthesisKitCat#638313。试剂盒还包括提取核酸的试剂，比如提取样本中总RNA的Trizol试剂，以及核酸检测试剂，比如PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。实验例本实验例提供对实施例5的试剂盒在检测待检血液样本中miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p的应用。具体包括样本的准备、总RNA的提取和荧光定量PCR反应及分析。本实施例共选取了2017年3月至2017年11月在青岛大学医学院附属医院心血管疾病的样本，所有病例均从病人本人或家属获得知情同意，相关病人信息完整并按规定建立临床资料数据库。排除标准包括：(1)合并严重心脏病患者如急性ST段抬高型心梗患者，严重瓣膜性心脏病患者，目的避免心脏本身器质性病变对研究的影响；(2)合并急性感染或慢性炎症处于急性发作期，避免炎症刺激对心力衰竭本身发病的影响；(3)合并恶性肿瘤或严重系统性疾病患者，如肾衰竭、肝衰竭患者；(4)疑似吸毒及酗酒患者；(5)拒绝参与此实验的患者。所有患者的血液样本均在术中严格按照标本采集规范进行采集。在病人血管抽取10mL外周血与普通EDTA抗凝的采血管中，立即置于4℃冰箱，静置30min，4℃条件下500g离心20min，目的去除血浆中残留的血细胞成分，吸取上层血浆，转移入一个新的离心管中，继续4条件下℃1500g离心20min，旨在彻底去除血浆中剩余的细胞碎片等物质，将所得血浆分装，与-80度冰箱保存。血浆总RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol试剂，分别取500μL病人血浆标本，分成250μL一管，共两管。进行总RNA的提取，具体提取方法如下：1.1分别加入750μL的Trizol试剂，上下颠倒，充分混匀，室温静置5min；1.2每管上述样本中加入5mL浓度为50pM的线虫miR(cel-miR-39-3p)用作外参；1.3每管按1:5的比例加入200μL的氯仿，上下颠倒，彻底混匀，直至完全变成乳白色为止，室温静置10min；1.4在4℃条件下12000g离心10min；1.5离心后，管内清晰可见三层，小心吸取上层无色水相600μL。1.6加入等体积的600μL异丙醇，同时加入3μL的糖原，上下颠倒混匀，-20℃冰箱静置过夜；1.7在12000g在4℃条件下离心10min，弃上清，注意勿倒掉沉淀之管底的RNA。1.8加入75％的DEPC水配置的酒精1mL，12000g在4℃条件下离心10min，弃上清；1.9加入无水乙醇1mL，在4℃条件下12000g离心10min，弃上清，室温静置5-10min，待RNA自然干燥。1.10用15μLRNAfree水稀释溶解，备用。荧光定量qPCR反应cDNA的合成RNA的浓度及纯度测定：应用了NaNodrop仪器进行RNA浓度和纯度测定。严格按照相关的操作规范进行使用，用DEPC水作为空白对照进行调零，取1μLRNA样本进行检测，获得该样本RNA浓度。一般A260/A280数值在1.8-2.1之间可用。cDNA的合成：严格按照TaKaRa一步法加A试剂盒的说明进行操作，具体组分如下：逆转录反应，具体程序如下：温度(℃)时间(min)376085545瞬时离心，加入90μL的无菌水定容到100μL体系。进行荧光定量PCR反应，具体反应程序及反应体系如下：每个样本设置3个重复是严控，加样至96孔板的PCR反应板中，按照三步法进行扩增。反应程序：反应体系：根据溶解曲线分析PCR扩增反应的特异性，获得每个样品的CT值。用cel-miR39-3p作为外参，根据2-ΔΔCT方法计算基因相对定量的表达；cel-miR39-3p的碱基序列为ucaccggguguaaaucagcuug，引物序列为TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG。结果如图1到图3所示，图1表示利用荧光定量PCR方法检测miR-155-5p实验结果，图2表示利用荧光定量PCR方法检测miR-216a-5p实验结果，图3表示利用荧光定量PCR方法检测miR-217F-5p实验结果；从结果中可以看出心衰样本与对照组比结果明显上升，说明所选的三个靶标miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p可以用来预估分析心衰样本。如图4到图6所示，图4表示利用荧光定量PCR方法检测miR-155-5p得到的ROC曲线，图5表示利用荧光定量PCR方法检测miR-216a-5p得到的ROC曲线，图6表示利用荧光定量PCR方法检测miR-217F-5p得到的ROC曲线；从ROC结果中可以看出相关的数值证明三个靶标miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p可以用来预估分析心衰样本。如图7到图9所示，图7为对检测miR-155-5p和miR-216a-5p在检测样本中的相关性分析；图8为对检测miR-155-5p和miR-217F-5p在检测样本中的相关性分析；图9为对检测miR-216a-5p和miR-217F-5p在检测样本中的相关性分析；从对比结果中可以看出靶标之间两两具有相关性。综上所述，本发明通过研究发现miR-155-5p、miR-216a-5p和miR-217F-5p具有与心脏疾病较好的相关性，可以用于评估心脏疾病，本发明提供的检测引物等具有较好的检测准确性。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。SEQUENCELISTING<110>青岛大学<120>miRNA在制备检测心脏病试剂、试剂盒中的应用及检测试剂、检测试剂盒<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>RNA<213>Homosapiens<400>1uuaaugcuaaucgugauaggggu23<210>2<211>22<212>RNA<213>miR-216a-5p<400>2uaaucucagcuggcaacuguga22<210>3<211>23<212>RNA<213>miR-216a-5p<400>3uacugcaucaggaacugauugga23<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>4ggaccttaatgctaatcgtgataggggt28<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>5ggactaatctcagctggcaactgtga26<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6ggactactgcatcaggaactgattgga27当前第1页1 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