本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种巨大芽孢杆菌利用牛肉膏生产亚油酸的方法。
背景技术：
巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）属于芽孢杆菌属，是一种很有潜力的功能型细菌，具有营养要求低、培养条件简便、繁殖迅速、安全无毒等优点，广泛应用于生物防治、净化水质、农药降解、微生物菌肥、抗生素合成、酶工业等领域。细菌中含有多种多不饱和脂肪酸，主要包括亚油酸(la)、共轭亚油酸(cla)、γ-2亚麻酸(gla)、花生四烯酸(ara)、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)等，是生物膜的重要组成成分，是生物活性物质的前体，对人体的健康具有重要意义。
亚油酸（linoleicacid）是一种人体不能自己产生，必须通过饮食获得的必需脂肪酸，作为一种多不饱和脂肪酸（pufa），它是比肉食或乳制品饱和脂肪更健康的饮食成分，能有效降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环，可预防或减少心血管病的发病率；共轭亚油酸作为亚油酸的异构体，具有抗癌、抗动脉硬化，杀死或抑制癌细胞产生的功效，还能促进脂类代谢，参与能量分配并促进生长，在动物饲养方面具有广阔的用途。目前，制备亚油酸大多以富含亚油酸的油脂为原料，经水解后得到混合脂肪酸，混合脂肪酸经分离、纯化后得到亚油酸。在工业上制备混合脂肪酸的方法较多，归纳起来有三类：一是合成法即石蜡氧化法或一烃氧化法，二是从造纸废液中回收妥尔油脂肪酸，三是从天然油脂无催化水解或经酶水解来制取，其生产工艺复杂、成本高、能耗大、稳定性差。微生物中多不饱和脂肪酸含量丰富，细菌多不饱和脂肪酸主要以磷脂或其他脂类形式存在于膜上，并且微生物生长不受季节、地域和气候的影响，发酵周期短，具有适应性强、生长繁殖迅速、易培养、不受原料产地限制等特点。因此，利用微生物生产多不饱和脂肪酸亚油酸是一条重要途径，细菌产pufa可以作为生物饵料，将其引入海洋水产养殖食物链，将对提高水产品pufa品质有重要意义。且细菌的遗传机制相对简单，研究生产多不饱和脂肪酸的方法将有利于阐明其pufa的合成机制，有助于提高细菌生产pufa的能力，在向其他生物进行转基因研究领域也具有良好的前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种产多不饱和脂肪酸亚油酸的条件稳定，培养基质容易获得，发酵条件稳定、工艺简单的利用巨大芽孢杆菌制备亚油酸的方法。
一种利用巨大芽孢杆菌制备亚油酸的方法，包括：
（1）菌种活化
将巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2）菌株接于na固体斜面培养基上，30±1℃静置培养1-2天，活化3次，保存于4℃冰箱备用；
（2）种子液的制备
将活化的巨大芽孢杆菌l2菌株利用接种环刮取两环接种于250mlnb液体种子培养基中，30±1℃，130-150r/min，摇瓶培养20-24h，得种子液；
（3）发酵培养
以6%（v/v）的比例将种子液转接到250mlnb发酵培养基中，30±1°c，130-150r/min，培养3天终止发酵，发酵液在5000-6000r/min、4°c下离心15-20min，进行菌液分离，除去发酵液，收集菌体细胞，即得。
上述的巨大芽孢杆菌利用牛肉膏生产亚油酸的方法，其中na固体斜面培养基的制备方法如下：蛋白胨10g，葡萄糖5g，氯化钠5g，牛肉膏3g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2；灭菌条件：121℃，15-20min。
上述的巨大芽孢杆菌利用牛肉膏生产亚油酸的方法，其中nb液体种子培养基的制备方法如下：蛋白胨10g，葡萄糖5g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2；灭菌条件：121℃，15-20min。
上述的巨大芽孢杆菌利用牛肉膏生产亚油酸的方法，其中nb发酵培养基的制备方法如下：葡萄糖15g/l，蛋白胨25g/l，牛肉膏4.58g/l，氯化钠3.23g/l，蒸馏水1000ml，ph值为7.0-7.2；灭菌条件：121℃，15-20min。
该菌种已于2012年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：cctccno：m2012381，名称为：巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2）。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：利用产亚油酸巨大芽孢杆菌l2对以牛肉膏为主的培养基进行生物降解与转化，发酵生产亚油酸，可为解决多不饱和脂肪酸来源提供一条新途径。且巨大芽孢杆菌l2（bacillusmegateriuml2）菌株来源可靠，对温度、ph等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，产多不饱和脂肪酸亚油酸的条件稳定，可作为提取多不饱和脂肪酸的菌株，扩充资源库。
具体实施方式
一种利用巨大芽孢杆菌制备亚油酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将巨大芽孢杆菌l2菌株接于na固体斜面培养基上，30±1℃静置培养1-2天，活化3次，保存于4℃冰箱备用；
（3）种子液的制备
将活化的巨大芽孢杆菌l2菌株利用接种环刮取两环接种于250mlnb液体种子培养基中，30±1℃，130-150r/min，摇瓶培养20-24h，得种子液；
（3）发酵培养
以6%（v/v）的比例将种子液转接到250mlnb发酵培养基中，30±1°c，130-150r/min，培养3天终止发酵，发酵液在5000-6000r/min、4℃下离心15-20min，进行菌液分离，除去发酵液，收集菌体细胞，即得。
巨大芽孢杆菌（bacillusmegaterium）l2菌体中多不饱和脂肪酸的鉴定：
（1）浸膏的制备
取上述所得菌体细胞置于鼓风干燥箱中，50-55℃烘至恒重，磨粉，过50-60目筛得菌粉，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到供试样品乙酸乙酯部分和水部分，并将乙酸乙酯部分旋蒸浓缩得到浸膏。
（2）样品的分离
取乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，按石油醚：乙酸乙酯（100:1,50:1,20:1，10:1,5:1,2:1,1:1），乙酸乙酯：甲醇（30:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1），v/v，纯甲醇体系冲柱，薄层紫外254nm检测，分为16个部分（le1-16），选取极性适中的le4，再次进行硅胶柱层析，按石油醚：乙酸乙酯（60:1,40:1），v/v，薄层紫外254nm检测，分为7个部分（le4-1-le4-7），取油状物质le4-5组分进行gc-ms分析，为脂肪酸类成分。
（3）gc-ms分析条件
气相色谱条件：色谱柱为ab-inowax（30m×0.25μm×0.25mm）毛细管柱，初始温度50℃（保持2min），升温至240℃（5℃/min），保持15min，运行时间：55min；汽化室温度250℃；载气为高纯he(99.999%)；柱前压7.65psi，载气流量1.0ml/min；进样量1μl；不分流。
质谱条件：离子源为ei源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70ev；发射电流34.6μa；倍增器电压1624ｖ；接口温度280℃；质量范围29~500amu；溶剂延迟时间：5.0min。
（4）结论：巨大芽孢杆菌l2菌体中的脂肪酸成分主要为亚油酸、十八碳烯酸、十五烷酸和棕榈酸，其中亚油酸作为不饱和脂肪酸，含量最高，为23.607%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。