本发明涉及一种用于高密度发酵的枯草芽孢杆菌，属于基因工程领域。
背景技术：
枯草芽孢杆菌bacillussubstilis是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力，目前广泛用于生产各种工业用酶。枯草芽孢杆菌遗传背景清晰，实验模式菌株b.subtilis168已完成全基因组测序，并根据发酵工艺需求改造成多种突变体，例如工业上使用的菌株b.subtiliswb600和b.subtiliswb800。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)wsh11是本实验室以枯草芽孢杆菌ws5为出发菌株，敲除nprb、bpr、mpr、vpr、epr和wpra基因，实现高密度发酵的菌株，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生。但泡沫产量仍需进一步降低，减少发酵过程中消泡剂的添加量。枯草芽孢杆菌在生长过程中分泌脂肽类生物表面活性剂，结构上含有亲水的肽键和疏水的脂肪烃链两部分，在液体表面聚集会产生泡沫，主要有表面活性素类(surfactin)，伊枯草素类(iturin)，芬芥素(fengicin)，大侧柏素(plipastain)，地衣素(lichenysin)，帕米拉素(pumilacidin)，多粘菌素(polymixin)等。枯草芽孢杆菌ws5含有表面活性素类、草素类、芬芥素、大侧柏素、地衣素的表达基因。在发酵过程中会产生大量泡沫，不利于发酵过程调控，影响菌体生长以及发酵产酶。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一株适用于保密度培养的枯草芽孢杆菌wsh13，以枯草芽孢杆菌wsh11为出发菌株，敲除ppse和sfp两个基因，减少发酵过程中泡沫产量。
本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述重组菌敲除了侧柏素合成酶ppse和4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶sfp两个基因。
在本发明的一种实施方式中，所述ppse基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述sfp基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌ws5、枯草芽孢杆菌wsh11或枯草芽孢杆菌cicimb0629为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌wsh11为宿主菌，所述枯草芽孢杆菌wsh11是以枯草芽孢杆菌cctccno:m2016536为出发菌，敲除nprb、bpr、mpr、vpr、epr和wpra基因得到。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌cctccno:m2016536在cn106754466a的专利申请文件中公开。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌cicimb0629保存江南大学工业微生物资源和信息中心，保藏编号为cicimb0629，保藏地址为中国无锡江南大学。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以质粒phy300为载体进行敲除。
本发明的第二个目的是提供所述枯草芽孢杆菌重组菌高密度发酵方法，所述方法是将所述重组枯草杆菌接种至发酵培养基中，控制ph6.5～7.5，培养温度30～35℃，先溶氧维持在25～35％至溶氧迅速上升，开始流加浓度为450～550g/l的葡糖糖补料液，当报告蛋白酶活下降时，结束培养。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有酵母粉15g/l，玉米浆25g/l，葡萄糖12g/l，(nh4)2-h-citrate1g/l，na2so32g/l，(nh4)2so42.68g/l，k2hpo4·3h2o19.2g/l，nah2po4·h2o4g/l，mgso4·7h2o1g/l，金属离子ptm溶液3ml/l。
在本发明的一种实施方式中，金属离子ptm溶液的组成：cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o0.5g/l，na2moo3·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，cocl20.5g/l，zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，生物素0.2g/l，h2so45.0g/l。
在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽孢杆菌发酵过程中将培养基中的葡萄糖消耗完全即出现溶氧反弹、溶氧迅速上升的现象。
在本发明的一种事实方式中，补料液培养基：葡萄糖500g/l，mgso4·7h2o7.89g/l，(nh4)2hpo463.36g/l，金属离子ptm溶液40ml。
在本发明的一种实施方式中，在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌穿梭载体phy300plk的基础上构建环糊精葡萄糖基转移酶表达质粒，转化枯草芽孢杆菌cicim2、wsh11或wsh13，用于表达报告蛋白环糊精葡萄糖及转移酶，检测宿主改造后是否影响胞外蛋白的表达。
本发明的第三个目的是提供所述重组菌在发酵产酶中的应用。
本发明的有益效果：
经过摇瓶和3-l罐上罐测定酶活和发酵过程中产泡沫的情况，本发明的重组菌wsh13为宿主时环糊精葡萄糖基转移酶的表达较好，对酶活影响较小，且发酵过程中，泡沫产量明显减少，有效降低消泡剂的使用量，发酵过程调控简便，有利于工业化生产。
附图说明
图1为ppse和sfp基因敲除的酶切验证核酸电泳图；其中，wt表示野生型；mt表示突变型。
图2为以枯草芽孢杆菌wsh11和wsh13为宿主重组表达环糊精葡萄糖基转移酶3-l罐发酵培养液面高度折线图。
图3为以枯草芽孢杆菌cicim和cicim2为宿主重组表达环糊精葡萄糖基转移酶3-l罐发酵培养液面高度折线图。
具体实施方式
环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法：
将2ml1％可溶性淀粉底物置于水浴锅内预热10min，然后加入适当稀释的环糊精葡萄糖基转移酶酶液0.1ml，反应10min后，加入0.2ml3mhcl终止反应，然后加入0.2ml甲基橙显色液，置于16℃反应15min。在505nm下测定吸光度，计算酶活。一个酶活单位(u)定义为每分钟生成1μmolα-cd所需的酶量。
实施例1：敲除质粒的构建
根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向ppse和sfp基因的sgrna，在本实验室前期构建的crispr/cas9敲除质粒phy300dsrf1的基础上(质粒的构建方法公开于2016年的论文《multigenedisruptioninundomesticatedbacillussubtilisatcc6051ausingthecrispr/cas9system》中)，设计引物pcr扩增突变原有sgrna，得到两个修饰过的敲除质粒；然后以枯草芽孢杆菌ws5基因组为模板，pcr扩增带有xbai酶切位点的同源修复臂片段，连到pmd-19t克隆载体上，转化jm109进行扩增。xbai分别酶切连有同源臂的克隆载体和敲除质粒，然后t4连接酶连接过夜，得到两个敲除质粒phy300ppse和phy300dsfp。
表1sgrna序列
表2xbai酶切体系为：
37℃酶切反应2h。
实施例2：枯草芽孢杆菌转化方法
1.感受态的制备
用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌，然后在lb平板上划线，37℃培养过夜活化。挑取单菌落接种于10mllb液体培养基中，37℃培养过夜培养8h。取2.5ml培养物接种至40ml含有0.5m山梨醇的lb培养基，37℃200rpm振荡培养至od600达到0.85-0.95之间。将菌液冰水浴10min，然后4℃5000rpm离心5min，收集菌体。用50ml预冷的电转培养基15-20ml重悬菌体，4℃5000rpm离心5min，去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，0.3ml分装至预冷灭菌的ep管。
2.枯草芽孢杆菌的电击转化
将50ng质粒加入0.3ml感受态细胞，冰上孵育2min，加入预冷的电击杯(1mm)，电击。
电击完毕后，取出电击杯并迅速加入1ml预冷的rm培养基。37℃200rpm振荡复苏培养3h后，离心去除大部分上清，重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃过夜培养。
培养基配方：
(1)lb+0.5m山梨醇：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，山梨醇91g/l。
(2)电转培养基：山梨醇91g/l，甘露醇91g/l，葡萄糖100g/l。
(3)rm：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，山梨醇91g/l，甘露醇69g/l。
实施例3：敲除基因ppse和sfp
分别用质粒phy300dppse和phy300dsfp敲除b.subtiliswsh11和b.subtiliscicimb0629基因组中的ppse和sfp两个基因。采用实施例2中的方法，将敲除质粒转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，涂布到lb固体培养基(含20μg/ml四环素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取基因组，以基因组为模板菌落pcr扩增同源修复片段，然后在37℃进行酶切验证。由于敲除基因的菌株进行基因组同源修复时在基因断裂处插入了酶切位点，在ppse基因内插入bamhi酶切位点，在sfp基因内插入ecori酶切位点，所以可以被相应的内切酶切开，而野生型的则不会被切开，酶切验证正确的基因敲除菌在51℃进行敲除质粒的消除(图1)。b.subtiliswsh11依次敲除基因ppse和sfp后分别得到2种基因敲除菌b.subtiliswsh12和b.subtiliswsh13。b.subtiliscicimb0629依次敲除基因ppse和sfp后分别得到2种基因敲除菌b.subtiliscicim1和b.subtiliscicim2。
表3酶切体系为：
37℃酶切反应0.5h。
实施例4：b.stearothermophilus来源的环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建
用于构建枯草芽孢杆菌表达载体的质粒是phy300plk，带有双启动子phpaii-pamyq’。分别以质粒phy300plk和质粒pet-20b(+)-cgtopt(吴敬,熊艳军,王蕾.一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用,cyclodextringlycosyltransferaseproducingstrainanditsapplication:,cn103667102b[p].2016.)为模板，用引物p1/p2和p3/p4pcr扩增出带有15bp同源序列的载体片段和基因片段，再用in-fusionhdcloningpluskit连接酶连接，连接产物转化e.colijm109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/l氨苄青霉素液体的lb中振荡培养，提取质粒，测序验证得到表达质粒phyα/βcgtd4。
表4pcr反应体系为：
反应程序如下：94℃预变性4min；98℃10s，55℃10s,72℃1.5min，进行30个循环；72℃延伸10min，降温至4℃。
表5引物序列
采用实施例2中的方法，将质粒phyα/βcgtd4转化b.subtiliswsh11、b.subtiliswsh13、b.subtiliscicim和b.subtiliscicim2，涂布含四环素(20mg/l)的lb平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体lb中，37℃培养过夜，保存甘油管，最终得到4种环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌b.subtiliswsh11-cgt、b.subtiliswsh13-cgt、b.subtiliscicim-cgt、b.subtiliscicim2-cgt。
实施例5：以枯草芽孢杆菌突变体为宿主的基因工程菌摇瓶酶活
对上述实施例4中4种环糊精葡萄糖基转移酶重组菌进行摇瓶培养，检验环糊精葡萄糖基转移酶表达情况，培养过程如下：吸取10μl的甘油管菌液接种于装有10mllb培养基的50ml三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h。将上述培养以5％(v/v)的接种量接入装有50mltb的250ml三角瓶中发酵罐，37℃，200rpm培养2h。然后33℃，200rpm培养48h。测定胞外环糊精葡萄糖基转移酶酶活。得出以wsh11为宿主菌时酶活为5.79u/ml，以wsh13为宿主菌时酶活为6.43u/ml，以b.subtiliscicim为宿主菌酶活为4.17u/ml，以b.subtiliscicim2为宿主菌酶活为3.28u/ml。结果表明，敲除基因sfp、ppse对b.subtiliswsh13产酶没有影响，b.subtiliscicim2稍有下降。
培养基配方：
(1)lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l。
(2)tb培养基：24g/l酵母粉，12g/l蛋白胨，5g/l甘油，12.54g/lk2hpo4，2.31g/lkh2po4。
实施例6：以枯草芽孢杆菌突变体为宿主的基因工程菌3-l罐发酵
对上述实施例4中4种环糊精葡萄糖基转移酶重组菌进行进行3-l发酵培养，检验环糊精葡萄糖基转移酶的表达情况及发酵液高度和消泡剂滴加量。培养过程如下：吸取200μl的甘油管菌液接种于装有100mllb培养基的500ml三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h，将上述培养液接入装液量为0.9l的3l发酵罐，以氨水和20％磷酸控制ph7.0，培养温度33℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，开始流加浓度为500g/l的葡萄糖补料液，当环糊精葡萄糖基转移酶酶活下降时结束培养。
培养基配方：
(1)lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l。
(2)发酵培养基：酵母粉15g/l，玉米浆25g/l，葡萄糖12g/l，(nh4)2-h-citrate1g/l，na2so32g/l，(nh4)2so42.68g/l，k2hpo4·3h2o19.2g/l，nah2po4·h2o4g/l，mgso4·7h2o1g/l，金属离子ptm溶液3ml/l。
补料液培养基：葡萄糖500g/l，mgso4·7h2o7.89g/l，(nh4)2hpo463.36g/l，金属离子ptm溶液40ml。
金属离子ptm溶液的组成：cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o0.5g/l，na2moo3·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，cocl20.5g/l，zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，生物素0.2g/l，h2so45.0g/l。
以wsh11为宿主菌时发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为110.3u/ml。以wsh13为宿主菌时发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为115.5u/ml。以cicim为宿主菌时发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为84.5u/ml，以cicim2为宿主菌时发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为70.3u/ml。
发酵过程中，记录发酵液高度，及消泡剂滴加量(图2、图3)，箭头表示滴加消泡剂ppe。wsh11滴加消泡剂0.565ml，wsh13滴加消泡剂0.167ml。cicim滴加消泡剂0.685ml，cicim2滴加消泡剂0.457ml。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种用于高密度发酵的枯草芽孢杆菌
<160>8
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>3837
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<213>人工序列
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