本发明涉及分子
技术领域：
：，特别涉及一种猪igf1r基因分子标记及其专用引物。
背景技术：
：：类胰岛素生长因子1型受体(igf1r)是胰岛素样生长因子igf-1发挥生物效应的主要介导者，对细胞增殖分化和机体生长发育起着重要作用。生长性状是猪的重要经济性状。igf1r基因是类胰岛素生长因子1型的受体基因，很多研究已表明，igf1r基因在动物的生长发育中起着重要作用，igf1r基因突变等造成的功能缺失会导致机体生长发育障碍或多种器官发育不全。根据nationalcenterbiotechnologyinformation(ncbi)上报道的外显子序列，猪igf1r基因编码区存在9个多态位点，分别位于基因第3、7、8、11、13、15、16、20外显子中，其中，第20外显子中存在g/a杂合型，g型编码缬氨酸，a型编码异亮氨酸。发明人在分子水平上通过对肉用猪种的igf1r基因的突变与猪的生长性状进行相关分析，为肉用猪种的选育与改良提供更多的理论依据。技术实现要素：本发明的目的是提供一种猪igf1r基因分子标记及其专用引物，具有能够对猪种igf1r基因20外显子突变位点进行快速、准确标记的效果。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于标记猪igf1r基因的引物，其特征是，引物序列如seqidno：1～2所示。进一步地，所述的引物组在猪种选育中的应用。通过常规pcr技术，利用所述引物对待测猪种dna进行pcr扩增，扩增产物通过限制性内切酶taqi酶切，酶切片段进行电泳检测，得到dna片段的基因型，得到长235bp左右的纯合片段即为生长性状优良的优势基因型。本发明的进一步设置为：所述pcr扩增体系为20μl，包括2μl的10×buffer、1.5μl的dntp、引物各0.8μl、8.1μl的taqdna聚合酶、1μl的dna模板，余量为ddh2o。本发明的进一步设置为：所述限制性内切酶taqi的反应体系为10μl，包括5μl的扩增产物、1μl的10×buffer、0.2μl的限制性内切酶taqi。本发明的进一步设置为：所述pcr反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃50sec,退火61℃30sec,延伸72℃30sec,扩增30个循环，最后72℃延伸10min。综上所述，本发明具有以下有益效果：能够快速、准确的对肉用猪种的igf1r基因变异位点进行标记，方便后期猪种的选育。附图说明图1是本发明中目的基因pcr扩增以后的电泳检测图；图2是本发明中酶切产物的电泳检测结果图。图1中m：为markerdl2000dna,1-10为引物自身扩增产物的检测结果图。图2中，m为markerdl2000dna,1-10为180个样本材料中选取的10个dna材料经引物pcr扩增的后的电泳检测图检测。具体实施方式以下结合附图对本发明作进一步详细说明。具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。实施例1，一、材料选取：本实验选用云南红河邦格牧业有限公司、惠嘉育种公司的杜洛克、长白猪和大约克作为实验对象。随机抽取两公司在相同饲养条件下的猪各60头。二、耳组织dna提取：将采集的耳组织样取下10mg，按常规酚/氯仿法抽提基因组dna，用te溶解dna样品，-20℃保存备用。三、引物的设计：引物的设计利用dcapsfinder2.0，引物详细信息如表1所示。表1引物名称、序列、产物大小及退火温度table1nameofprimer,primersequence,lengthandannealingtemperature四、pcr扩增及扩增产物的rflp检测：1、采用pcr扩增试剂盒扩增目标片段。本实验pcr反应总体积为20μl，反应体系各组分如表2所示，反应条件优化结果如表3所示。扩增产物的检测如图1所示，所用的maker为dl2000dna(北京全式金生物技术有限公司提供)表2目的基因pcr扩增优化的反应体系table2optimalreationsystemofpcrofaimgene表3igf1r基因多态引物的pcr反应条件优化结果table3theoptimalconditionsofpcrforigf1rgenepolymorphic2、限制性内切酶具有特异的酶切位点，序列比对分析发现rflp技术检测exon-20扩增目的片段的突变位点，相应的限制性内切酶是：taqi，限制性内切酶信息见表4。表4限制性内切酶的识别位点及反应温度table4digestedlocationsandtemperatureoftherestrictionenzyme酶切反应：按以下体系配制酶切反应混合液，见表5。表5限制性内切酶taqi的反应体系(单位：μl)table6optimumsystemoftaqirestrictionenzymereaction(unit:μl)酶切产物的电泳检测：用1.5％的琼脂糖胶检测，取5μl酶切产物与适量溴酚兰混匀后点样，同时dl2000dnamarker(北京全式金生物技术有限公司提供)取5μl点样，110v电泳10～20min；最后使用凝胶成像系统检测酶切结果如图2所示。外显子20的第73位点存在g/a杂合型，g型为缬氨酸，a型为异亮氨酸。将该酶切位点存在时产生的纯合酶切片段类型定为基因型aa，不存在时产生的酶切片段类型定为基因型bb，产生的杂合酶切片段类型定为基因型ab，图2中5、10为aa型；2为bb型；1、3、4、6～9为ab型。参照图1、图2本发明所述引物序列如seqidno：1～2所示的引物能够快速、准确的对肉用种猪的igf1r基因第20外显子g/a突变位点进行检测标记，利于后期猪种的选育。五、统计分析1、基因频率和基因型频率的计算方法(1)基因频率pi＝2[(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)]/2n其中，pi：第i个等位基因的频率j1，j2，…，jn：与i共显的第1到n个等位基因(2)基因型频率基因型频率＝基因型个体数/测定群体总数2、基因频率和基因型频率的差异显著性检验首先根据基因频率计算各种基因型频率的理论值，然后计算χ2。当自由度df＝1，基因型理论值小于5，可采用校正公式：式中，oi为实际观察值；ei为理论值；n为等位基因数。3、不同位点遗传多态性分析(1)遗传纯合度与杂合度纯合度是某一群体中一特定位点上等位基因纯和的程度，杂合度与纯合度相对。纯合度与杂合度公式如下：其中，pi为某一位点上第i个等位基因的频率，n为某一位点上的等位基因数。(2)有效等位基因数有效等位基因数是衡量群体遗传变异的一个指标，是基因纯合度的倒数。等位基因在群体中分布越均匀，有效等位基因数越接近实际检测到的等位基因的绝对数。计算公式如下：(3)多态信息含量pic是用于对标记基因多态性的估计，现在常用来表示标记dna变异高低程度的指标。pic>0.5为高度多态，0.5>pic>0.25为中度多态，pic<0.25为低度多态。一个标记在群体中的pic值是根据其等位基因的频率来计算的。pi和pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率，n为等位基因数。4、核苷酸多态位点与性状关系的分析(1)数据来源于处理试验猪的生长性状指标来自于云南红河邦格牧业有限公司、惠嘉育种公司猪场的记录。将所有个体的基因、基因型及相应的生长性状用excel建立数据库。用sas统计分析软件，根据相应模型进行相关的数据处理。(2)处理数据的模型本试验采用最小二乘法模型对2个核苷酸变异位点的不同基因型与性状的关系进行分析。对各生长性状用以下模型统计：yijklm＝μ+ai+bj+ck+rl+eijkl式中，yijklm：生长性状的记录值；μ：群体均值；ai：场效应；bj：品种效应；ck：性别效应；rl：基因型效应；eijkl：随机残差效应。验证试验：本实验对64头杜洛克(公猪29头、母猪35头)，64头长白猪(公猪20头、母猪44头)，大白猪75头(公猪6头，母猪69头)进行了8项主要生长性能的测定，测定结果见果见表6。表6不同猪种生长性状测定table6determinationofgrowthtraitsofdifferentpigbreeds5、猪igf1r的基因频率和基因型频率基因频率和基因型频率见表7。igf1rexon20基因在三种猪群体中的优势基因为b等位基因。表7猪igf1r的基因频率和基因型频率table7genotypeandallelicfrequenciesofigf1rgeneinpig6、猪igf1r基因的群体遗传特性igf1r基因在3个群体中的杂合度、有效等位基因数、多态信息含量及χ2检验结果见表8。由表8看出，igf1rexon20基因中，长白猪群体中多态信息含量大于0.25且小于0.5，杂合度为0.4409，说明该基因位点在长白猪群体中处于中度多态；杜洛克和大白猪群体中多态信息含量小于0.25，杂合度分别为0.2637和0.1011，说明该基因位点在这两个群体中处于低度多态。表8基因位在猪群体中的多态信息含量(pic)、杂合度(h)、有效等位基因数(ne)及χ2检验table8dataofheterozygosities(h),effectivenumberofalleles(ne),polymorphisminformationcontents(pic)7、猪igf1r基因的多态性与生长性状的关联分析igf1r基因在三个群体中的不同基因型的生长性状的最小二乘均值及标准误参见表9。igf1rexon20基因三种基因型30～50kg日增重bb>aa>ab型，bb型与ab型之间差异极显著(p<0.01)；30～100kg日增重bb>aa>ab型，bb型与ab型之间差异显著(p<0.05)；达30kg校正日龄三种基因型bb、aa、ab呈略微递减，70日龄重，达50kg校正日龄，达100kg校正日龄，达100kg校正膘厚，50～100kg日增重都是ab型最大，均差异不显著。表9不同基因型与性状的最小二乘均值及标准误table9thelsmandstd.errorofdifferentgenotypesofdifferenttraits注：不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示无显著差异。8、不同品种不同基因型个体生长性状的最小二乘均值差异显著性检验igf1r-exon20基因在三个群体中的不同基因型的生长性状的最小二乘均值及标准误见表10。在杜洛克猪群中，所有基因分型的生长性状之间差异均不显著；在长白猪群中，30～50kg日增重bb>aa>ab型，bb型与ab型之间差异显著(p<0.05)；在大白猪群中，30～50kg日增重aa>bb>ab型，aa型与ab型之间差异显著(p<0.05)，50～100kg日增重ab>aa>bb型，bb型与ab型之间差异极显著(p<0.01)。三种猪群在70日龄重，达30kg校正日龄，达50kg校正日龄，达100kg校正日龄，达100kg校正膘厚中差异均不显著。表10不同品种不同基因型与性状的最小二乘均值及标准误differentvarietiesoflsmandstd.errorofdifferentgenotypesandtraits注：不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示无显著差异。igf1r基因第20外显子g/a突变位点检测到3种基因型aa、ab、bb，各基因型频率在杜洛克群体中分别为：0.0156、0.2813、0.7031；在长白猪群体中分别为：0.3125、0.0313、0.6562；在大白猪群体中分别为0.0400、0.0267、0.9333。三种基因型30～50kg日增重bb>aa>ab型，bb型与ab型之间差异极显著(p<0.01)；30～100kg日增重bb>aa>ab型，bb型与ab型之间差异显著(p<0.05)；说明igf1rexon-20的突变bb基因型对于猪的30～50kg日增重有显著影响。当前第1页12当前第1页12