本发明属于水稻分子遗传与育种学领域，具体地说，涉及一种检测抗稻瘟病复等位基因pi-2/gm/zt的通用分子标记及应用。
背景技术：
由真菌(magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是一种世界性的水稻病害，是我国水稻生产上的三大病害之一，具有发生范围广、流行速度快、破坏性大、病原菌易变异等特点，严重造成水稻减产和降低稻米品质。实践证明，水稻抗病品种的选育与种植是控制稻瘟病最有效的措施。然而，我国幅员辽阔，南北稻区自然气候条件差异大，耕作制度也不尽相同，稻瘟病菌生理小种类型丰富多样，相同的抗性基因在不同的稻区存在显著的抗性差异，再加优势生理小种易发生变化，导致抗病品种在种植几年后会逐渐丧失其抗性。因此，合理的挖掘和利用广谱抗性基因或者聚合多个抗病基因，是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，不仅要求育种者具备的丰富经验和敏锐的观察力，而且鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响而造成误差，选育效率低下。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越受到关注。通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的标记物进行分子标记辅助选择，不仅大大加快了育种步伐，而且可以降低育种成本，提高了选择效率，因此利用分子育种技术选育含有抗稻瘟病基因的品种是培育抗稻瘟病最经济有效的方法。
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，稻瘟病抗性基因陆续被定位、克隆。目前已至少有90多个抗稻瘟病基因得到准确定位，其中26个已经成功克隆。这些基因分布在除水稻第3染色体外的各条染色体上，其中多个基因成簇分布在水稻的第6和11染色体上。位于第6染色体着丝粒附近的pi-2位点是稻瘟病抗性基因密集区域，到目前为止克隆了5个复等位基因，分别是pi-gm、pi-2、pi-zt、pi-9和pi-50。位于第11号染色体长臂近端粒处的pi-1位点也是稻瘟病抗性基因密集区域，到目前为止克隆了6个复等位基因，分别是pi-1、pi-k、pi-kh、pi-kp、pi-ke和pi-km。研究证明pi-gm、pi-2、pi-zt、pi-9和pi-50中单个nbs-lrr基因已具有广谱抗瘟作用，其中，pi2和pi-zt的lrr区域仅8个氨基酸残基的差异就产生了不同的产物及抗性。不同稻区pi-gm、pi-2、pi-zt、pi-9和pi-50的稻瘟病抗性存在显著的差异。如pi-zt在湖北抗性欠佳，但在江西具有很好的利用价值。水稻品种“谷梅4号”的pi-gm基因是抗谱广且抗性持久的基因之一，对不同地区和国家的30多个强致病菌株中表现出高抗或免疫，但感湖北恩施的1个菌株，因此合理利用复等位基因对不同的稻瘟病生理小种抗性差异，把同位点的不同复等位基因导入到父母本中，通过杂交配组，进一步提高杂交稻的稻瘟病抗性，从而延长品种的种植寿命。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种检测抗稻瘟病复等位基因pi-2/gm/zt的通用分子标记及应用，通过检测与抗稻瘟病复等位基因pi-2/gm/zt紧密连锁的分子标记，可以确定水稻亲本或杂交后代是否含有抗稻瘟病基因pi-2或pi-gm或pi-zt，从而提高抗稻瘟病水稻新品种的分子辅助选择效率。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测抗稻瘟病复等位基因pi-2/gm/zt的通用分子标记的引物对，该引物对为：
f:5’-gcagggtaactcctattt-3’，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
r:5’-aatcagaccttacatcacag-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明还公开了一种检测抗稻瘟病复等位基因pi-2/gm/zt的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测水稻样品基因组dna；
2)利用权利要求1所述的引物对进行pcr扩增；
3)检测抗性基因供体亲本和需要改良材受体亲本是否存在多态性，如果存在多态性，则利用下述条件进行判断：
如果pcr扩增产物出现单独的480bp或者同时出现480bp和269bp时，则待检测水稻样品含有抗稻瘟病基因pi-2或pi-gm或pi-zt基因；否则，则待检测水稻样品不含抗稻瘟病基因pi-2或pi-gm或pi-zt基因。
可选地，步骤2中的pcr扩增的pcr反应体系为：10xpcr反应缓冲液2ul，5pm引物f和r各1ul，10mmdntp0.5ul，dna样2ul，taqdna聚合酶0.2ul，加ddh2o补足至20ul。
可选地，步骤2中的pcr扩增的pcr反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，72℃保温10分钟，10℃下放置。
本发明还公开了一种上述的方法在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。
本发明还公开了一种含有上述引物对的试剂盒。
本发明还公开了一种上述的试剂盒在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明在利用这三个等位基因分别导入到不同的品种过程中，所需开展的分子标记辅助育种时，以往的标记检测需要分别针对其供体基因采用对应的三个引物来做三次pcr检测，才能检测每个单株的是否含有抗性基因的信息，而采用本发明侧只需用一个引物做一次pcr检测，就能得到每个单株是否含有抗性基因的信息，减少了pcr重复次数，降低了劳动强度，提高了工作效率。
2)本发明三个抗性基因供体材料与其它背景材料之间多态性好，抗感材料pcr扩增的dna片段之间碱基序列差异有约有220个碱基，只需要在2.0％的琼脂糖凝胶中电泳30分钟，就能清晰地分析出每个单株是否含有抗性基因，缩短了实验室的分子检测时间，提高了检测效率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明indel-2gmzt引物检测26个材料的电泳图；每个条带中上方的片段是目标基因所具有的扩增片段，其中，1、谷梅4号(pi-gm)，2、irbb5(pi-2)，3、谷梅2号(pi-gm)，4、irbl11(pi-zt)，5、地谷b，6、福伊b，7、华占(pi-2)，8、中组14(pi-2)，9、中恢8006，10、9311，11、蜀恢527，12、日本晴，13、春江06，14、嘉禾212，15、珍汕97b，16、岳4b，17、jr7599，18、jr3385，19、ir24，20、安丰a(pi-1、pi-2)，21、02428，22、r1128，23、赣恢934(pi-gm)，24、赣恢986(pi-gm)，25、明恢86(pi-zt)，26、早抗b(pi-2)；
图2是本发明indel-2gmzt引物检测r9113///r9113//r9113/谷梅4号bc2f2的48个单株的电泳图；每个条带中上方的片段是目标基因所具有的扩增片段，其中，1是谷梅4号，2-47为46个bc2f2单株，48是r9113；
图3是本发明indel-2gmzt引物检测早显b//早显b/安丰bbc1f4的48个抗稻瘟病株系的电泳图；每个条带中上方的片段是目标基因所具有的扩增片段，其中，1是安丰b，2-47为46个bc1f4的稻瘟病抗性单株，48是早显b；
图4是本发明indel-2gmzt引物检测r350////r350///r350//r350/bl11(pi-zt)的bc3f248个株系的电泳图；每个条带中上方的片段是目标基因所具有的扩增片段，其中，1是bl11，2是r350，3-48为46个bc3f2的单株；
图5是本发明indel-2gmzt引物检测中组14/r9113//r9113bc1f2株系、jr7599////jr7599///jr7599//jr7599/谷梅4号bc2f2株系及r463///r463//r463/bl11bc2f2株系的电泳图；每个条带中上方的片段是目标基因所具有的扩增片段，
其中，1-1至6-7为中组14/r9113//r9113bc1f2株系中的bc1f2的47单株，6-8为中组14///r9113//r9113bc1f2株系中的中组14(pi-2)；12-8和18-8是jr7599////jr7599///jr7599//jr7599/谷梅4号bc2f2株系中的谷梅4号，7-1至18-7为jr7599////jr7599///jr7599//jr7599/谷梅4号bc2f2株系中的bc2f2的94个单株；24-8为r463///r463//r463/bl11bc2f2株系中的bl11(pi-zt)，19-1至24-7为r463///r463//r463/bl11bc2f2株系的bc2f2的47单株。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1检测水稻抗稻瘟病基复等位基因的分子标记方法的建立
1)在基因pi-2上下游各100kb附近用日本晴的碱基，在ncb工网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用blast程序将日本晴的序列与籼稻品种9311的序列进行比对，获得15个具有碱基插入或缺失的位点，用primer5设计了15对引物，提取具有pi-2、pi-9、pi-gm、pi-zt抗性基因的供体材料及日本晴和9311的dna，用15对引物进行pcr扩增，在4％的琼脂糖凝胶中电泳分离，用gelred染色后，在凝胶成像仪紫外灯下扫描拍照和分析。15对引物扩增结果发现，引物indel-9(标记命名为indel-2gmzt)在具有pi-2、pi-gm、pi-zt抗性基因的供体材料与日本晴和9311之间具有非常好的多态性。
indel-2gmzt引物信息：
f:5’-gcagggtaactcctattt-3’，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
r:5’-aatcagaccttacatcacag-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
退火温度55℃。
2)取26个亲本材料的少量叶片[编号：1、谷梅4号(pi-gm)，2、irbb5(pi-2)，3、谷梅2号(pi-gm)，4、irbl11(pi-zt)，5、地谷b，6、福伊b，7、华占(pi-2)，8、中组14(pi-2)，9、中恢8006，10、9311，11、蜀恢527，12、日本晴，13、春江06，14、嘉禾212，15、珍汕97b，16、岳4b，17、jr7599，18、jr3385，19、ir24，20、安丰a(pi-1pi-2)，21、02428，22、r1128，23、赣恢934(pi-gm)，24、赣恢986(pi-gm)，25、明恢86(pi-zt)，26、早抗b(pi-2)，提取dna，dna提取按照2％ctab的小修改后的方法提取，用indel-9引物(命名为indel-2gmzt)进行pcr扩增，在2.0％的琼脂糖凝胶中电泳分离，用gelred染色后，在凝胶成像仪紫外灯下扫描拍照和分析，具有pi-2、pi-gm、pi-zt抗性基因的材料与其它不具有抗性基因的材料具有非常好的多态性，但也出现两个带有粳稻血源的材料能扩增出目的条带。紧密连锁indel-2gmzt多态率高，84.3％的受体亲本与供体亲本pi-2/gm/zt之间存在多态；indel-2gmzt的pcr产物差异较大，能快速检测出材料的标记基因型。通过用分子标记检测待检材料，可以判断其是否携带抗病基因pi-2或pi-gm或pi-zt，序列差异效果结果见图1，由图1可知，抗性基因供体材料与其它很多亲本之间的多态性具有显著的差异，易于分别。
3)dna提取按照2％ctab的简单修改后方法提取(murraymg,
thompsonwf.rapidisolationofhighmolecularweightplantdna.nuceleicacidsresearch,1980，8(19):4321-4325，根据分子标记辅助选择的需要，省去了用70％酒精洗脱dna步骤和增加了提取的dna用烘箱50度温度烘半个小时)。pcr反应体系以20ul计为：10xpcr反应缓冲液2ul，5pm引物f和r各1ul，10mmdntp0.5ul，dna样2ul，taqdna聚合酶0.2ul，加ddh2o补足至20ul。
pcr反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，72℃保温10分钟，10℃下放置。
其中，引物f的核苷酸序列如seqidno.1所示；引物r的核苷酸序列如seqidno.2所示；合成的前后引物各1od直接稀释成5pm浓度使用。
4)pcr电泳检测结果分析：
三个抗稻瘟病基因pi-2、pi-gm和pi-zt的供体材料，pcr扩增产物为480bp，84.3％的受体亲本与供体亲本pi-2/gm/zt之间存在多态，但02428和r1128这2个材料也能扩增出与具有上述抗性基因供体亲本类似相同片段，因此，要利用该分子标记来做这三个抗性基因的分子辅助选择，首先要检测抗性基因供体亲本和需要改良材受体亲本是否存在多态性。如果存在多态性，就能利用该标记，在后续的分子标记辅助选择中，单独480bp或者同时出现480bp和269bp时，则待检测水稻样品含有抗稻瘟病基因pi-2或pi-gm或pi-zt基因；否则，则待检测水稻样品不含抗稻瘟病基因pi-2或pi-gm或pi-zt基因。
实施例2
取r9113///r9113//r9113/谷梅4号的bc2f2的46个单株叶片用indel-2gmzt引物进行检测，实验过程如上程序。1是谷梅4号，2-47为46个bc2f2单株，48是r9113；如图2所示，其中编号2、5、6、7、8、9、11、12、15、19、20、22、24、26、29、33、34、36、37、43、47的21个单株携带基因pi-gm的杂合型，编号10、14、16、21、27、28、30、31、32、41、44的的11个单株携带基因pi-gm的纯合型。
实施例3
用分子标记辅助回交选择的早显b//早显b/安丰b的bc1f4株系，种植在井冈山稻瘟病自然诱发鉴定圃，取抗稻瘟病的46个株系中的单株叶片用inde1587引物进行检测，实验过程同上。1是安丰b，2-47为46个bc1f4的稻瘟病抗性单株，48是早显b。如图3所示，其中编号16、17、20、25、30的5个单株携带基因pi-2的杂合型，编号2、3、7、8、10、11、12、13、15、18、19、21、22、23、24、26、27、28、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47的的35个单株携带基因pi-2的纯合型，编号4、5、6、9、14、29的6个单株没有携带基因pi-2而具有稻瘟病抗性，是因为这6个株系携带基因pi-1的结果。
实施例4
取用分子标记辅助回交选择r350////r350///r350//r350/bl11(pi-zt)的bc3f2的种子，种植在井冈山稻瘟病自然诱发鉴定圃，取抗稻瘟病的46个株系中的单株叶片，提取dna，用indel-2gmzt引物进行pcr检测，实验过程如上程序。1是bl11，2是r350，3-48为46个bc3f2单株。如图4所示，其中编号4、5、7、8、12、13、14、16、18、19、21、22、24、26、27、28、29、30、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48的32个单株携带基因pi-zt的杂合型，编号3、6、10、11、15、23、25、31、42的的9个单株携带基因pi-zt的纯合型。编号9、17、20、33、41的5个单株没有携带基因pi-zt而具有稻瘟病抗性，可能这5个株系还携带有其它抗性基因。
实施例5
选取种植三个不同复等位抗性基因经分子标记辅助选择有抗性基因的回交的株系：中组14(pi-2)/r9113//r9113bc1f2，从中取47株叶片，编号1-1至6-7，其中6-8为中组14；jr7599////jr7599///jr7599//jr7599/谷梅4号bc2f2，从中取94株叶片，编号为7-1至18-8，其中12-8和18-8是谷梅4号；r463///r463//r463/bl11(pi-zt)bc2f2从中取47株叶片，编号19-1至24-7，其中24-8为bl11，分别提取dna，用indel-2gmzt引物同时在两块pcr板中进行pcr检测，每块pcr板上dna样品均含有两种不同的抗性基因型，实验过程如上程序。如图5所示，1-2、1-6、1-7、2-2、2-4、2-5、3-6、3-8、4-5、4-8、5-5和6-7共计12个单株携带基因pi-2的纯合型，7-3、7-6、8-4、8-8、9-4、9-7、9-8、10-4、10-7、11-1、11-6、11-7、12-2、12-3、13-6、13-7、13-8、14-1、14-5、15-2、15-4、15-5、16-3、17-5、17-7、18-1、18-3和18-7共计28个单株携带基因pi-gm的纯合型。19-1、19-4、19-6、20-2、20-3、20-6、20-7、21-2、22-7、24-4和24-5共计11单株携带基因pi-zt的纯合型。
开展水稻分子标记辅助选择，实验室的工作是一个重要的环节，尤其做pcr、pcr产物电泳和结果分析，是非常耗时耗力的工作，通常需要在短时间用确定目标株系以便田间及时完成杂交或回交。该引物针对在利用这三个不同复等位抗性基因开展分子改良时可以通用，在做pcr时省去了频繁换引物的麻烦，减少了出差错的概率，且引物的多态性好，只需要在2％的琼脂糖凝胶中电泳，30分钟后就可分离，缩短了实验时间。通常一个工作人员一天可以完成800-1200个样品的做pcr、电泳和结果分析等任务，提高了实验效率。尽管该引物是与目标抗性基因紧密连锁的标记，但在利用三个不同复等位抗性基因导入到8个不同遗传背的品种中，通过该引物分子辅助选择含有纯合抗性基因的株系，2015-2017年在江西井岗山稻瘟病自然诱发圃鉴定稻瘟病抗性，经分子标记辅助选择的抗性株系自然诱发稻瘟病的抗性鉴定效果明显，具体结果见表1。尽管三个不同复等位抗性基因导入在不同的遗传背景的品种中，但分子标记辅助选择的效率均大于90％以上，个别材料达到100％，显示出很好的抗性改良选择效果。
表1是经本发明indel-2gmzt分子标记辅助选择的具有纯合抗性基因的株系和轮回亲本井岗山稻瘟病自然诱发鉴定的抗性结果
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>江西省农业科学院水稻研究所
<120>一种检测抗稻瘟病复等位基因pi-2/gm/zt的通用分子标记及应用
<130>2018
<141>2018-04-27
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gcagggtaactcctattt18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aatcagaccttacatcacag20