本发明属于基因技术，具体涉及针对dj-1基因的sgrna，具有高的编辑效率，以及包含sgrna及其载体与应用。
背景技术：
：dj-1（park7）是较常见的常染色体隐性遗传帕金森致病基因，其对帕金森病的致病机制不明确，有待于研究。crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/cas9)基因编辑系统是自zfns、talens发展而来的第三代基因编辑系统，是从细菌的适应性免疫防御系统中发现，用来对抗外源dna以及入侵的病毒，目前已经被广泛的应用于生物医学领域。crispr/cas9的特点是其设计简单、成本低廉、识别不受基因甲基化影响、编辑效率高、能同时靶向多个靶点以及含有pam位点的任意序列等。以前的研究已经证明由crrna的3'末端与tracrrna的5'末端形成的sgrna可以指导cas9核酸酶剪切与crrna序列互补的靶序列。剪切靶序列后，细胞修复dna双链断裂的方式分为同源重组修复（hdr）和非同源末端连接（nhej）两种。在shinmyo等人的研究中，3条sgrna序列被设计用于小鼠大脑satb2基因的敲除，但是它们之间的编辑效率差别巨大。所以，相对高效率且较低脱靶效应的sgrna的选择对于crispr/cas9基因编辑的广泛应用是决定性的。评价一个特定靶序列的sgrna的特异性和有效性，目前有以下几种方法被广泛应用，如t7endonucleasei实验，pcr产物测序，digenome-seq技术，guide-seq技术，htgts技术，idlv法和在线工具预测，但这些方法通常费时费力，需要的仪器设备要求较高或者预测不准确。针对特定的靶基因，大量的sgrna序列可以被设计，因为cas9酶可以酶切任何毗邻pam位点的靶序列，但每一条sgrna的编辑效率都不一样，如pam位点是5'-ngg-3'的编辑效率通常就比5'-nga-3'或5'-nag-3'的高。crispr/cas9系统基因编辑效率的高低受到多种因素影响，其中不同sgrna序列之间特异性的高低对其影响尤为重要。在crispr/cas9技术出现之前，在细胞层面研究基因功能，普遍使用rna干扰（rnai）技术，只能使基因的表达降低，而不能在dna水平完全敲除，这是crispr/cas9的最大优势。在crispr/cas9应用过程中，sgrna特异性的高低很大程度决定了crispr/cas9编辑效率的高低。技术实现要素：本发明公开了一种dj-1基因最优sgrna，为以后的基因疗法提供参考。本发明采用如下技术方案：一种针对dj-1基因的sgrna，所述针对dj-1基因的sgrna的序列为seqidno.1。一种针对dj-1基因的药物，包括seqidno.1所示的sgrna。上述技术方案中，所述针对dj-1基因的药物还包括药物载体，比如常规聚合物载体、细胞载体等。一种针对dj-1基因的质粒，包括seqidno.1所示的sgrna。优选的，所述针对dj-1基因的质粒为装载有seqidno.1所示的sgrna的pspcas9(bb)-2a-gfp质粒。seqidno.1所示的sgrna在制备针对dj-1基因药物中的应用。seqidno.1所示的sgrna在制备治疗或者缓解帕金森药物中的应用。本发明中所述seqidno.1的序列为：5'-acatcacggctacactgtactgg-3'。本发明通过白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系证实了上述序列的编辑效率，达到75%。首先，pmd-19t质粒上编码β-gal区域的部分序列被一段含有靶序列的长序列替换，从而形成移码突变，替换后的质粒称为pmd-repeat质粒，单独转化在含有x-gal和iptg的固体培养基中不能形成蓝色菌落；当与装载有靶序列对应sgrna的pcas9质粒共转化时，pmd-repeat质粒中靶序列会被sgrna引导的cas9蛋白酶切，靶序列前后两段重复序列发生同源重组，使编码β-gal的基因序列由移码恢复为非移码状态，在x-gal和iptg诱导下，形成蓝色菌落。构建含有sgrna序列的原核细胞基因敲除pcas9质粒和含有对应靶序列的pmd-repeat质粒，两种质粒等量共转化到dh5α感受态细胞，在含有x-gal-tptg-氯霉素-氨苄青霉素的培养基培养，观察蓝色菌落占全部菌落比例。构建含有sgrna序列的真核细胞基因敲除pspcas9(bb)-2a-gfp质粒，转染hela细胞，发挥基因编辑作用后，提取对照组和实验组中细胞基因组，在sgrna上下游区域设计引物，q5高保真酶pcr，产物纯化，t7e1酶消化，琼脂糖凝胶电泳，观察电泳后条带结果；设计测序引物，纯化后的产物测序，观察cas9酶切位点附近有无套峰以及套峰的高低。数据证明，本发明公开了针对dj-1基因的sgrna具有最优编辑效率；转染hela细胞后，会造成基因阅读框移码，翻译提前终止，dj-1基因被敲除。转染hela细胞后，dj-1基因完全敲除，验证了本发明sgrna具有优异的编辑效率，实施例证实其构建单克隆基因敲除细胞株的可行性和有效性，通过细胞增殖实验，发现dj-1基因敲除后的细胞株细胞增殖减缓；同时，为进一步的dj-1机制研究提供有效细胞工具。附图说明图1为pcas9质粒的sgrna克隆示意图；图2为pmd-repeat质粒lacz基因部分碱基序列图；图3为pmd-repeat质粒sgrna对应的靶序列插入测序结果图；图4为白变蓝克隆形成实验原理示意图；图5为白变蓝克隆形成实验dj-1-sgrna双质粒共转化菌落图；图6为白变蓝克隆形成实验dj-1-sgrna双质粒共转化蓝色菌落占总菌落比值图（n=3，mean±sd）；图7为pspcas9(bb)-2a-gfp质粒sgrna4序列插入测序图；图8为dj-1敲除的单克隆hela细胞株westernblot图；图9为dj-1敲除的单克隆hela细胞株免疫荧光图；图10为细胞增殖实验结果图。具体实施方式1.1实验细胞人宫颈癌hela细胞株由苏州大学药学院王光辉课题组提供。1.2主要仪器仪器名称厂家4℃冰箱青岛海尔-20℃低温冰箱日本sanyo公司-80℃低温冰箱日本sanyo公司梯度pcr仪杭州朗基5810r低温高速离心机德国eppendorf公司常温高速离心机德国eppendorf公司milli-q超纯水仪美国millipore公司微量移液器德国eppendorf公司数显鼓风干燥箱上海博讯电子分析天平美国sartorius公司dk-600b电热恒温水槽上海精宏公司隔水式恒温培养箱上海一恒科学仪器公司凝胶成像分析系统复日科技恒温震荡培养箱上海一恒科学仪器公司ddy-5型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂airtech净化工作台苏净集团高压灭菌锅上海博讯nanodrop2000/2000c分光光度计美国thermo公司co2培养箱美国thermo公司ix71型荧光显微镜日本olympus公司1.3主要试剂1.3.1菌株与载体菌株/载体名称厂家ecoli.dh5α菌株北京天根公司pmd-19t(a1360)美国promega公司pcas9质粒北京溯源精微科技有限公司pspcas9(bb)-2a-gfp（px458）美国addgene公司1.3.2相关试剂盒试剂盒名称厂家离心柱型质粒小提试剂盒北京天根公司(货号#dp103-03)离心柱型dna纯化回收试剂盒北京天根公司(货号#dp214-02)血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒北京天根公司(货号#dp304-02)1.3.3其他试剂都为市购产品。1.4试剂溶液配置1.4.1100mg/ml氨苄青霉素用10mlddh2o溶解1g氨苄青霉素，0.22μm过滤膜过滤除菌。每份1ml分装，-20℃贮存。1.4.225mg/ml氯霉素用10ml无水乙醇溶解0.25g氯霉素，0.22μm过滤膜过滤除菌。每份1ml分装，-20℃贮存。1.4.3lb液体培养基称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加入200ml的ddh2o搅拌溶解，配置5mol/l的naoh溶液调ph到7.0，用ddh2o定容到1l，进行分装（10mlep管，每管加入5ml），高压蒸汽灭菌，121℃，40min；4℃保存。1.4.4lb固体培养基称取酵母提取物2.5g，胰蛋白胨5g，氯化钠5g,琼脂粉7.4g，加入200ml的ddh2o搅拌溶解，配置naoh溶液调ph到7.0，用ddh2o定容到500ml，高压蒸汽灭菌，121℃，40min，冷却至一定温度后，若配amp固体培养基，加入300µl的100mg/ml氨苄青霉素；若配氯霉素固体培养基，加入25mg/ml氯霉素500µl；若配蓝白固体培养基，加入100mg/ml氨苄青霉素和25mg/ml氯霉素各500µl，20mg/mlx-gal2100µl，24mg/mliptg500µl，混合均匀后铺板，晾干封口膜封口4℃保存。1.4.550×tae电泳缓冲液称取tris碱24.2g，量取冰醋酸5.7ml，0.5mol/ledta10ml，加入ddh2o定容至100ml。使用时稀释50倍至1×。1.4.61×pbs量筒量取10×pbs50ml，加入双蒸水定容至500ml。1.4.7人宫颈癌细胞系hela培养基取dmem培养基450ml，加入胎牛血清50ml，青链霉素0.7ml，混合均匀，4℃保存。1.4.8琼脂糖凝胶制备称取3g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150ml1×tae缓冲液，混合，加热溶解，置室温冷却，加入7.5µleb，轻轻摇匀，倒入合适的制胶盘的胶槽中，冷却。实施例针对dj-1基因的sgrna，所述针对dj-1基因的sgrna的序列为seqidno.1，具体为5'-acatcacggctacactgtactgg-3'，简称sgrna4。对比例选取另外两条sgrna作为对比，具体如下：seqidno.2：5'-agtacagtgtagccgtgatgtgg-3'，简称sgrna1seqidno.3：5'-ctgcacagatggcggctatcagg-3'，简称sgrna2。1、根据常规方法构建装载有上述3个dj-1sgrna的原核细胞基因敲除crispr/cas9质粒，具体见附图1；pcas9质粒酶切体系见表1，37℃水浴锅酶切过夜，酶切后产物与未酶切质粒同时琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示切开后，加入到1.2%琼脂糖凝胶槽孔中，120v电泳约30min，以1kbdnamarker为参照，切胶纯化回收，纯化回收的实验步骤如下：（1）向吸附柱加入500µl平衡液bl，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；（2）从凝胶上切下目的条带，且可能多的切除多余凝胶，切下的凝胶称重；（3）根据凝胶重量，向凝胶中加入等体积pc（若凝胶为0.1g，则体积视为100µl，加入的pc体积为100µl），56℃水浴10min，期间不断颠倒混匀；（4）将溶解得到的液体冷却室温，吸取到吸附柱中，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；（5）向吸附柱中加入600µlpw（漂洗液pw中已加无水乙醇），静置4min，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管，重复此操作一次；（6）将含有吸附柱的收集管以12000rpm空离2min，于室温晾干数分钟；（7）取一个新的离心管，将吸附柱放入，吸取30-50µlddh2o于吸附柱中，放置2min，12000rpm离心2min，所得溶液即为纯化后质粒酶切产物。表1pcas9载体酶切体系2、sgrna序列的磷酸化将金唯智公司合成的oligo稀释成10μm，磷酸化，oligosgrna序列见表2，磷酸化体系见表3，37℃，30min。表2用于插入pcas9质粒的sgrna序列表3磷酸化体系sgrna退火，加入2.5μl1m氯化钠到磷酸化产物中，使用pcr仪退火2h，从95℃慢慢冷却至室温，终产物稀释10倍。3、连接，连接体系见表4，体系16℃反应过夜。表4连接反应体系4、转化（1）取50µldh5α感受态细胞置于冰上，加入上述连接后20℃产物，轻轻混匀，放置30min；（2）在42℃水浴锅中热击45sec，迅速放于冰中放置10min；（3）加入无抗生素的lb液体培养基800µl，37℃，220rpm恒温振荡培养50min；（4）在超净台中，将菌液用移液枪转移到含氯霉素的lb固体培养基上，静置20min，倒置于37℃恒温培养箱培养；（5）12h后，挑取10个菌落到含有氯霉素的lb液体培养基中培养，提取质粒。5、质粒dna的提取按照天根公司的质粒小提试剂盒(货号#dp103-03)操作说明进行操作（1）向吸附柱加入500µl平衡液bl，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；（2）5ml过夜培养的菌液，12000rpm离心15min，倒掉上清；（3）加入250µl溶液p1（试剂盒自带，已加rnasea）到含有菌体沉淀的离心管中，漩涡振荡，使沉淀溶解；（4）加入250µl溶液p2（试剂盒自带），上下颠倒温和混匀8~10次，使菌体裂解；（5）立即加入350µl溶液p3（试剂盒自带），上下颠倒温和混匀10次，此时有白色絮状沉淀出现，12000rpm离心10min；（6）将离心管中上清液用移液枪转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管；（7）向吸附柱中加入600µlpw（漂洗液pw中已加无水乙醇），静置2min，12000rpm离心1min，丢弃其中废液，将吸附柱重新放置于收集管，重复此操作一次；（8）将含有吸附柱的收集管以12000rpm空离2min，于室温晾干数分钟；（9）取一个新的离心管，将吸附柱放入，吸取100µlddh2o于吸附柱中，放置2min，12000rpm离心2min，用nanodrop2000测其质粒浓度和纯度。鉴定提取的质粒送苏州金唯智公司测序，检测目的片段是否正确插入到质粒中，保存备用。6、重组pmd-repeat质粒-靶序列的构建pmd-repeat质粒是从pmd-19t质粒改造而来。以hiv部分序列为参照，设计一个长序列去取代pmd-19t质粒lacz基因中kpni和hindiii酶切位点间的原始序列，长序列中包含两段hiv重复序列和一段靶序列，长序列连接后，质粒上原有的kpni和hindiii酶切位点突变消失，两段重复序列和靶序列之间的kpni和hindiii酶切位点可以用于插入sgrna对应的目的靶序列。改造后质粒lacz基因的阅读框发生移码，产生终止密码子，不能形成α-互补，称为pmd-repeat质粒，pmd-repeat质粒lacz基因的阅读框被改造后的碱基序列如图2，pmd-repeat质粒lacz基因部分碱基序列，红框代表hiv重复序列；黑框代表靶序列，红框与黑框之间是kpni和hindiii酶切位点。7、pmd-repeat质粒酶切、胶纯化回收pmd-repeat质粒中含有的长序列包含有kpni和hindiii酶切位点，在重复序列和靶序列之间，酶切后，可以插入目的靶序列。pmd-repeat质粒用kpni和hindiii酶切，酶切体系见表5，37℃水浴反应2h；酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶纯化回收。表5pmd-repeat质粒的酶切体系sgrna对应靶序列的寡核苷酸互补将苏州金唯智公司合成的与3条dj-1sgrna对应的靶序列寡核苷酸链互补。反应体系为：10×annealbuffer2μl，oligof1μl（10μm），oligor1μl（10μm），加ddh2o16μl，总体积20μl。反应条件为：95℃，2min；每30sec降1℃至65℃；65℃，5min；每1min降1℃至25℃；25℃，1min，再冷却至4℃，靶序列寡核苷酸链序列见表6。表6用于插入pmd-repeat的靶序列寡核苷酸链连接将纯化回收后的pmd-repeat质粒与退火后的互补寡核苷酸链进行连接，体系见表7，16℃过夜反应，pmd-repeat质粒sgrna对应的靶序列插入测序结果见图3。表7pmd-repeat质粒载体的连接体系转化将连接后的产物转化到dh5α感受态细胞中，加入800μllb液体培养基，37℃，40min振荡培养，在含有氨苄青霉素抗性的平板上37℃培养，12h后，挑取5个菌落到含有氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，提取质粒；提取的质粒送苏州金唯智公司测序，检测靶序列是否正确插入到质粒中，保存备用。8、重组pspcas9(bb)-2a-gfp质粒-sgrna的构建构建3个装载有dj-1sgrna的真核细胞基因敲除crispr/cas9质粒。pspcas9(bb)-2a-gfp质粒酶切、胶纯化回收，pspcas9(bb)-2a-gfp质粒酶切体系见表8，37℃水浴反应4h；酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶纯化回收。表8pspcas9(bb)-2a-gfp载体酶切体系将金唯智公司合成的oligo稀释成10μm，磷酸化，oligosgrna序列见表9；磷酸化体系见表10，37℃，30min。磷酸化后的产物使用pcr仪退火2h，95℃，5min；每1min降1℃至25℃；25℃，1min，再冷却至4℃。慢慢冷却至室温，终产物稀释10倍；然后连接，连接体系见表11，16℃反应过夜；将连接后产物转化到dh5α感受态细胞中，加入800μllb液体培养基，37℃，40min振荡培养，在含有氨苄青霉素抗性的平板上37℃培养，12h后，挑取5个菌落到含有氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，提取质粒，提取的质粒送苏州金唯智公司测序，检测靶序列是否正确插入到质粒中，保存备用。表9用于插入pspcas9(bb)-2a-gfp质粒的sgrna序列表10磷酸化体系表11连接反应体系9、白变蓝克隆形成实验当含有sgrna序列的pcas9质粒和含有该sgrna对应的靶序列的pmd-repeat质粒共转化dh5α感受态细胞时，cas9酶会在sgrna介导下识别并切割靶序列，引起dna双链的断裂，两段重复序列之间会发生同源重组，仅仅只有一条重复序列会存在lacz基因的阅读框，由移码状态变成非移码状态，在x-gal和iptg诱导下，形成蓝色菌落，实验原理示意图见图4。共转化实验含有sgrna序列的pcas9质粒和含有该sgrna对应的靶序列的pmd-repeat质粒等量转化到50μldh5α感受态细胞时，加入800μllb液体培养基，37℃，40min振荡培养，在含有x-gal-tptg-氯霉素-氨苄青霉素的平板上37℃培养，观察蓝色菌落占总菌落的比例；挑取蓝色菌落，在含有氯霉素-氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中培养12h，用pmd-19t的通用引物测序，观察靶序列是否被酶切并发生重复序列间的同源重组。10、白变蓝克隆形成实验结果装载有dj-1sgrna的pcas9质粒分别和对应的装载有靶序列的pmd-repeat质粒等量共转化dh5α感受态细胞，在x-gal-iptg-cl-amp平板上培养，重复三次，代表性的菌落生长图如图5。通过dj-1的3条sgrna的菌落图，可以发现本发明的sgrna（seqidno.1）的蓝菌占全部菌落比值较高（75%）而对比sgrna（seqidno.2、seqidno.3）的蓝菌占全部菌落比值低（<8%，约1%），如图6。说明本发明sgrna的编辑效率高。在每个平板中都挑取蓝色菌落到含有cl-amp的lb液体培养基培养，送菌液测序，pmd-repeat质粒修复测序图都一致，如图7。在白变蓝克隆形成实验中，pmd-19t质粒lacz基因部分序列的替换破坏了β-gal的阅读框，单独转化时，不能产生β-gal，表现白色菌落；当与含有靶序列对应的sgrna序列的pcas9质粒共转化时，cas9酶会在sgrna的引导下剪切对应的靶序列，形成dna双链断裂（dsb），两段重复序列发生同源重组，纠正了β-gal的阅读框，在x-gal和iptg诱导下，形成蓝色菌落。蓝色菌落占所有菌落的比例反映了该sgrna的编辑活性，若sgrna编辑活性低，靶序列被酶切的pmd-19t质粒少，菌落中白色菌落占全部菌落比值就高。从上可以看出，本发明公开的sgrna具有优异的编辑效率，取得了意想不到的技术效果。实施例二根据上述常规方法构建装载本发明sgrna（seqidno.1）的pspcas9(bb)-2a-gfp质粒。根据上述常规转染体系，吸取0.8μg构建成功的pspcas9(bb)-2a-gfp质粒、2μl的lipo2000于分别加有50μl预热omem培养基的离心管中，轻轻混匀，静置5min；再将两管溶液混合，轻微振荡混匀，静置20min。吸除细胞培养基，用pbs溶液洗涤，24孔板中每孔加入100μl混合溶液和100μl预热omem培养基，放入5%的co2培养箱37℃培养4h，再加入200μl完全培养基，培养12h，吸除培养板中液体，加入1ml完全培养基，放入5%的co2培养箱37℃培养48h。同时进行实验组（含有seqidno.1的sgrna）和阴性对照组（不含有sgrna）的转染。单细胞克隆的制备、培养实验组和对照组质粒转染hela细胞48h后，pbs洗涤，胰蛋白酶消化，培养基中和，1000rpm，5min离心，500μlpbs溶液重悬细胞，40μm细胞滤网过滤，质粒带有gfp标签，若转染进细胞，在激发光作用下，发出绿色荧光。以细胞是否带有荧光，96孔板每孔一个单细胞，进行流式细胞仪分选。分选出的单细胞克隆用含15%fbs的培养基培养，中间换液、补液，20天左右，当细胞克隆长满96孔小孔底部时，吸除培养基，加入100μlpbs溶液轻轻洗涤，吸弃，加入100μl胰蛋白酶在含5%的co2培养箱消化，显微镜观察细胞变圆即将脱落时，吸去胰蛋白酶溶液，加入200μl培养基轻微吹打混匀，转移至24孔培养板，补足培养基体积至1ml，放入co2培养箱37℃培养。按照细胞传代的方法，从24孔板转移至6孔板，再转移至中皿，一部分细胞冻存，一部分细胞继续培养。蛋白质免疫印迹（westernblot）细胞蛋白样本制备（1）将处理后的细胞内培养基吸弃，加入预热pbs溶液洗涤，吸弃；（2）加入适量胰蛋白酶在含5%的co2培养箱消化，直至细胞基本脱落；（3）加入适量培养基中和胰蛋白酶，轻轻吹打混匀，直至细胞全部脱落；（4）转移至1.5ml离心管，1000rpm，5min；吸弃离心管内上清，尽量吸干净，同时沉淀不被吸走；（5）加入一定体积细胞裂解液，吹打混匀，冰上静置10min左右；（6）加入与细胞裂解液同样体积的2×samplebuffer，振荡混匀；（7）在超声波细胞粉碎机下，以200w功率超声粉碎3下；（8）样品插于泡沫板上，沸水煮样10min，样品保存于-20℃。sds-page凝胶电泳（1）将玻璃板固定在配胶架上，配置所需浓度的聚丙烯酰胺分离胶，倒于缝隙间，加异丙醇压平；（2）大约30min，胶凝固后，配置浓缩胶，倒去异丙醇，用双蒸水洗涤3次，倾斜沥干，再加浓缩胶，插入梳子；（3）大约30min胶凝固后，拔掉梳子，安装到电泳槽中，倒入1×eb，上样以及蛋白marker；（4）120v电泳，15min左右，待样品进入分离胶，调成150v，继续电泳；（5）当样品接近胶下缘时，停止电泳。转膜（1）pvdf膜放入甲醇激活，向盘中倒入遇冷的1×tb；（2）按照海绵-两张滤纸-pvdf膜-分离胶-两张滤纸-海绵的顺序摆放，加紧夹子，转移至转膜槽中，放入冰块，以及预冷的1×tb；（3）恒流转膜，260ma，2h。封闭转膜结束后，将pvdf膜放入5%脱脂奶粉中，摇床轻轻晃动30min。抗体孵育（1）用1×tbst按一定比例稀释一抗，冰中保存。根据marker大小条带分布，剪刀剪出目的蛋白条带；（2）将目的蛋白条带放入稀释后的一抗溶液中，4℃过夜；（3）倒去一抗，用1×tbst清洗膜，置于摇床轻轻晃动10min，重复一次；（4）用1×tbst按一定比例稀释二抗，将pvdf膜放入二抗溶液中，摇床轻轻晃动2h；（5）倒去二抗，用1×tbst清洗膜两次，每次置于摇床轻轻晃动5min，再用1×tbs清洗两次，每次置于摇床轻轻晃动5min。ecl化学发光显影（1）ecl显影液中a、b液按1：1比例混合，清洗后的膜用卫生纸吸干残留液体，置于混合液中，孵育2min；（2）将膜放于托盘上，置于化学发光成像仪中，显影，成像。将装载有sgrna4的pspcas9(bb)-2a-gfp质粒和空白spcas9(bb)-2a-gfp质粒分别按常规转染方式转染hela细胞，48h后将带有绿色荧光的细胞，每孔一个单细胞用流式细胞仪分选到96孔板，继续培养，生长至适宜密度，依次转移至24孔板、6孔板以及中皿。装载有sgrna4的pspcas9(bb)-2a-gfp质粒转染后分选的单克隆细胞记为hela-dj-1-ko组；空白spcas9(bb)-2a-gfp质粒转染后分选的单克隆细胞记为hela-dj-1-wt组。为了确认dj-1是否被完全敲除，分别提取hela-dj-1-wt和6株hela-dj-1-ko细胞的蛋白，进行westernblot检测。以β-actin作为内参蛋白，结果如图8，同hela-dj-1-wt相比，hela-dj-1-ko中的dj-1完全没有表达，说明dj-1基因敲除的hela细胞株构建成功。在6株单克隆细胞株中，dj-1基因完全敲除，也验证了本发明sgrna结果的可靠性与优异的编辑效率。免疫荧光实验细胞固定移除细胞培养板内培养基，pbs溶液洗涤后吸弃，加入适量4%多聚甲醛，静置5~10min。吸弃多聚甲醛溶液，pbs溶液洗2~3次。打孔吸干pbs溶液，加入0.25%tritonx-100，于摇床轻轻晃动5min。再加入pbs溶液洗2~3次。封闭加入pbst溶液（在pbs溶液中加0.1‰tween20），于摇床轻轻晃动1h，再加pbst溶液洗3次。孵育一抗吸弃孔内液体，加入一定量的用pbst稀释的一抗，于摇床轻轻晃动4h，吸弃孔内液体，用pbst洗3次。孵育二抗吸弃孔内液体，加入一定量的用pbst稀释的荧光二抗，用铝箔包裹，于摇床轻轻晃动2h，吸弃孔内液体，用pbs洗3次。dapi染核用pbs溶液按一定比例稀释dapi，加入到孔内，避光染色5min，pbs洗3次，再加适量pbs，显微镜下拍照。为了进一步确定单克隆hela细胞中dj-1的敲除效果，利用荧光二抗标记的dj-1抗体检测细胞内dj-1表达，选取hela-dj-1-ko1，2以及hela-dj-1-wt进行免疫荧光实验，免疫荧光图如图9。免疫荧光图显示，同hela-dj-1-wt相比，hela-dj-1-ko1,2中的dj-1是完全敲除的。dj-1knockout细胞基因组pcr测序将免疫印迹实验和免疫荧光实验中显示dj-1完全敲除的细胞提取基因组，在sgrna上下游序列中设计引物，进行pcr，产物纯化后连接t载体，运用ta克隆的方法，对dj-1基因被编辑的部分序列测序，与原基因组比对，在dna水平上检测dj-1敲除是否成功。通过免疫印迹实验和免疫荧光实验，选取hela-dj-1-ko1和ko2提取细胞基因组，设计引物pcr，连接t载体，对sgrna作用的靶点附近测序，测序结果与野生型基因组比对，hela-dj-1-ko1在cas9酶切位点附近共造成了1bp和11bp的缺失；hela-dj-1-ko2在cas9酶切位点附近共造成了1bp的插入和5bp的缺失。以上突变均可以造成dj-1阅读框的改变，dj-1基因不能被表达。证明在dna水平上dj-1敲除成功，获得了dj-1基因敲除的单克隆hela细胞株。cck-8法检测细胞增殖（1）实验组和对照组细胞经过pbs洗涤、胰酶消化、培养基中和，离心，用新鲜培养基重悬，再稀释至一定倍数，对细胞进行计数。（2）稀释至每毫升30000个细胞数，混匀，以每孔100μl加到96孔板内，放入co2培养箱中培养。（3）12h待细胞贴壁后，每孔加入10μlcck-8试剂，以加入相应量的细胞培养基、cck-8试剂但没有细胞的孔作为阴性对照。（4）放入co2培养箱中孵育1h，酶标仪设定450nm，测定吸光度值。实验组和对照组分别设置设置5个复孔。（5）以上述测定数值记作12h，在细胞加入96孔板培养24h、48h、72h、96h时间点，分别进行上述操作，得到各个时间点的吸光度值。（6）上述实验重复三次。为评价dj-1敲除后对人宫颈癌hela细胞增殖的影响，选取hela-dj-1-ko1，2以及hela-dj-1-wt进行cck-8实验。每孔3000个细胞，每种细胞设置5个复孔，分别在12h、24h、48h、72h、96h时间点，用酶标仪测出各个孔的吸光度值。实验结果如图10。在crispr/cas9应用过程中，sgrna特异性的高低很大程度决定了crispr/cas9编辑效率的高低。本发明公开的针对dj-1的sgrna具有最优编辑效率中，可以发现，3条sgrna编辑效率相差很大，从<1%到75%，选用sgrna4后，在单克隆细胞株里dj-1基因完全敲除，说明本发明最优编辑效率的sgrna是重要的。序列表<110>苏州大学张家港工业技术研究院苏州大学<120>针对dj-1基因编辑的sgrna筛选及其载体与应用<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acatcacggctacactgtactgg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agtacagtgtagccgtgatgtgg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgcacagatggcggctatcagg23<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaacagtacagtgtagccgtgatg24<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaaacatcacggctacactgtact24<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aaacctgcacagatggcggctatcg25<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aaaacgatagccgccatctgtgcag25<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aaacacatcacggctacactgtacg25<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aaaacgtacagtgtagccgtgatgt25<210>10<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10agcttcagtacagtgtagccgtgatgtggggtac34<210>11<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cccacatcacggctacactgtactga26<210>12<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agcttcctgcacagatggcggctatcaggggtac34<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ccctgatagccgccatctgtgcagga26<210>14<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14agcttcacatcacggctacactgtactggggtac34<210>15<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cccagtacagtgtagccgtgatgtga26<210>16<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16caccgagtacagtgtagccgtgatg25<210>17<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17aaaccatcacggctacactgtact24<210>18<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18caccgctgcacagatggcggctatc25<210>19<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19aaacgatagccgccatctgtgcagc25<210>20<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20caccgcacatcacggctacactgtac26<210>21<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21aaacgtacagtgtagccgtgatgtgc26当前第1页12