本发明属于生物制药领域，涉及制备重组腺病毒的方法，尤其涉及重组腺病毒基因治疗产品gmp大规模生产的方法和工艺。
背景技术
经过几十年的研究和发展，基因治疗领域已有了长足的发展，并实现了产品突破。中国深圳赛百诺基因技术公司的今又生重组腺病毒p53产品、荷兰uniqure公司的glybera重组腺相关病毒(aav)产品和美国sparktherapeutics公司的luxturna重组腺相关病毒(aav)产品已先后获得政府医药监管机构的批准而上市，给患者和社会带来了福音和效益。传统的实验室基因治疗产品的制备方法已不能满足基因治疗产品gmp大规模产业化的要求。迫切需要开发能满足gmp生产技术要求并经济有效的大规模生产方法和工艺。
技术实现要素：
本申请的一个方面提供了生产重组腺病毒的方法，包括：将重组腺病毒包装细胞工作细胞库的细胞扩增，将扩增的细胞接种到填充床生物反应器进行再扩增，收获再扩增的重组腺病毒。
本申请的另一个方面提供了填充床生物反应器在生产重组腺病毒中的用途。
附图简述
图1表示重组腺病毒大规模生产方法和过程的流程图。
图2为表示填充床生物反应器(例如，celligenplus,newbrunswickscientific,co.inc.usa)的结构(a)和工作原理(b)；其中：(a)加入培养基；(b)收获；(c)可调节的收获水准管；(d)无细胞培养基；(e)充气的培养基使盘床饱和；(f)通气室中筛选的气泡；(g)引流管；(h)纤维床篮；(i)pbs收获；(j)进入空气；(k)轴承箱；(l)叶轮端口；(m)分布器管线；(n)水套；(o)聚酯盘；(p)无细胞流出物；(q)培养基计算；(r)水套水流出；(s)水套水进入。
图3(a)和图3(b)为表示fibra-celdisks的高清结构。
图4为根据本申请的一个实施方案的方法的流程图。
具体实施方式
在本申请的一个实施方案中，提供了生产重组腺病毒的方法，包括：将重组腺病毒包装细胞工作细胞库的细胞扩增，将扩增的细胞接种到填充床生物反应器进行再扩增，收获再扩增的重组腺病毒。
在一个实施方案中，填充床生物反应器为celligenplus(newbrunswickscientific,co.inc.usa)或者icellis(pallcorporation，usa)。
在一个实施方案中，重组腺病毒的生产细胞是具有贴壁生长特性的克隆细胞。
在一个实施方案中，重组腺病毒的生产细胞是具有贴壁生长特性的sbn-1293克隆细胞。
在一个实施方案中，填充床生物反应器的填料包括聚酯和聚丙烯。
在一个实施方案中，填充床生物反应器的填料包括聚酯网和聚丙烯支撑架。
在一个实施方案中，所述方法还包括将收获的重组腺病毒进行以下一个或多个：过滤、浓缩、核酸酶处理和离子交换层析纯化。
在一个实施方案中，采用切向流微滤和/或切向流超滤系统对重组腺病毒溶液进行过滤。
在一个实施方案中，采用阴离子交换柱层析纯化重组腺病毒。
在一个实施方案中，采用sepharoseqxl树脂或sourceq树脂纯化重组腺病毒。
在本申请的一个实施方案中，提供了填充床生物反应器在生产重组腺病毒中的用途。
在一个实施方案中，重组腺病毒的生产细胞是具有贴壁生长特性的克隆细胞。
在一个实施方案中，重组腺病毒的生产细胞是具有贴壁生长特性的sbn-1293克隆细胞。
在一个实施方案中，填充床生物反应器的填料包括聚酯和聚丙烯。
在一个实施方案中，填充床生物反应器的填料包括聚酯网和聚丙烯支撑架。
在一个实施方案中，提供了适合gmp大规模生产重组腺病毒基因治疗产品的方法，成功实现了重组腺病毒p53产品的产业化。
在一个实施方案中，提供了改进的大规模生产重组腺病毒的方法，其采用生物反应器和全自动的柱层析分离纯化，实现了更加经济有效的大规模工业化gmp生产重组腺病毒产品。
在一个实施方案中，生产方法包括以下主要步骤：细胞扩增；生物反应器接种，培养液灌注和细胞再扩增；重组腺病毒感染和扩张；重组腺病毒培养液收获，滤清和浓缩；核酸酶处理；全自动离子交换柱层析分离纯化；产品配制和灌装。
在一个实施方案中，本申请的方法具有很好的放大性，可以满足医药监控组织对gmp生产的各项技术要求，充分保证了产品的质量和生物活性。
在一个实施方案中，本发明提供了大规模生产重组腺病毒的方法。上游采用填充床生物反应器进行三维高细胞浓度培养贴壁生长的sbn-1293克隆细胞用于重组腺病毒的感染和扩增。与其他两维贴壁细胞培养和悬浮细胞培养方法相比，效率高更适合于gmp生产环境的要求。下游采用全自动的柱层析分离纯化，实现了更加经济有效的大规模工业化gmp生产重组腺病毒产品，用于癌症患者的临床治疗。本申请的生产方法包括了以下主要步骤：细胞扩增；填充床生物反应器接种，培养液灌注和细胞再扩增；重组腺病毒感染和扩张；重组腺病毒培养液收获、滤清和浓缩；核酸酶处理；全自动离子交换柱层析分离纯化；产品配制和灌装。该方法具有良好的放大性和经济性，并可以满足医药监控对gmp生产的各项技术要求。充分保证了产品的质量和生物活性。
图1表示了本申请一个实施方式的重组腺病毒大规模生产方法和过程的流程图。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤(所有的操作过程都在gmp洁净室内进行)：
细胞扩增
取重组腺病毒包装细胞工作细胞库的细胞，细胞量约5×106到1×107。细胞融化后接种到细胞培养用t型瓶内，接种密度约0.5×104到5×104/cm2。在37℃下载5％二氧化碳孵箱内培养至细胞密度约为90％。用胰蛋白酶-edta将细胞脱壁收获，将收获的细胞接种到更多的t型瓶内来扩增细胞。接种密度依然保持在0.5×104到5×104/cm2。重复细胞扩增的操作，直到有足够量的细胞用于接种生物反应器。
生物反应器接种，培养液灌注和细胞再扩增
本发明采用了填充床生物反应器(例如，celligenplus,newbrunswickscientific,co.inc.usa)来进行大规模细胞培养。图2表示填充床生物反应器的结构和工作原理。
将约250克的fibra-celdisks(newbrunswickscientific,co.inc.)包装在清洗过的填充床生物反应器的不锈钢篮内。然后加入10升pbs到生物反应器内。在连接所需的橡皮管和生物探头后，将生物反应器在121℃的灭菌柜内灭菌45分钟。
采用的fibra-celdisks是包括聚酯网和聚丙烯支撑架或由聚酯网和聚丙烯支撑架所构成。图3(a)和图3(b)表示fibra-celdisks的高清结构。
细胞在fibra-celdisks的表面和内部空隙生长，进而可以达到很高的细胞浓度。
先将pbs溶液从消毒灭菌后的生物反应器内去除，然后加入5升dmem+10％fbs的细胞培养液。将从t型瓶受获的细胞接种到生物反应器内进行培养。细胞接种量约1×109至1×1010。培养液的ph和溶氧(do)值由生物反应器的控制器通过ph和溶氧探头来自动控制。将ph控制为6.5至8.2，将do控制为15％至75％。通过水套中的循环水将培养液的温度自动控制36℃至37℃。由反应器的旋转搅拌桨提供培养液的搅拌。将搅拌速度控制为50为200rpm。
使细胞在生物反应器内生长5-10天。在细胞接种后第3天，开始灌注培养液，从而不断提供养分且排除细胞代谢有害副产品。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于0.5g/升。在生长5天后，可以进行重组腺病毒的感染。
重组腺病毒感染和扩张
取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞。病毒感染复数控制在10至100vp/细胞之间。然后再培养7天。在病毒感染3-5天后，重组腺病毒会释放至培养液内。此时开始收获含有重组腺病毒的培养液，直到培养过程结束。每天收获的含有重组腺病毒的培养液斩时存放在4℃的冷库，最后汇总处理纯化。
重组腺病毒培养液滤清和浓缩
首先将汇总收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质。再将滤清的收集液用另外一个300kdmwco的切向流超滤系统浓缩约10至50倍。对浓缩的收集液进一步进行渗滤处理，将收集液转移到另外一个缓冲液内，以方便接下来的核酸酶处理和离子交换柱层析分离纯化。渗滤系数为3至10。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数被控制在5至20psi之间。为了提高核酸酶处理的效率，可以在加入核酸酶前，用缓冲液稀释浓缩和渗滤过的收集液。
核酸酶处理
本过程采用了benzonasetm，一个广泛用于生物制品生产过程的广谱内核酸酶。将benzonasetm加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子。剂量在10-20u/ml之间。降解处理在37℃的水浴中进行1个小时。
全自动离子交换柱层析分离纯化
在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化benzonasetm处理过的重组腺病毒收集液。纯化过程采用unicorn软件控制的全自动的纯化系统。将阴离子交换树脂(例如sepharoseqxl)装柱于bpg300的色谱柱内，装柱体积约2.5升。在使用色谱柱前，先对色谱柱进行hetp(heightequivalenttotheoreticalplate)检测，以保障色谱柱的性能是合格的。在装柱载样前，首先用1.0n的naoh溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的色谱柱进行消毒处理。处理后的色谱柱首先用a缓冲液(20mmtris,ph8.0)平衡。色谱柱平衡后，开始将重组腺病毒收集液装柱。装柱后，用5至8倍柱体积的a缓冲液清洗色谱柱直到uv吸收值到底线为止。紧接着用30倍柱体积的a缓冲液到b缓冲液(20mmtris,ph8.0,2mnacl)的线性nacl梯度来洗脱吸附在色谱柱上的重组腺病毒。在洗脱过程中unicorn软件通过对260nm的uv吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现。当260nm的uv吸收值升到0.1au时，将纯化的重组腺病毒峰对应的重组腺病毒被自动接收至消毒无菌的瓶内。当260nm的uv吸收值降到0.2au时，停止接收。然后，依次用碱液、缓冲液和酸液洗涤色谱柱和纯化系统。最后将色谱柱和纯化系统存放于0.1nnaoh的存储液内。
产品配制和瓶装
首先将柱层析纯化后的重组腺病毒用小型的300kdmwco的切向流超滤系统(例如milliporepellicon系统)进一步浓缩，以达到重组腺病毒产品的病毒滴度的指标(例如，1×1012vp/ml)。然后用重组腺病毒产品的配液(例如20mmtris-hcl,ph8.0,含有10％的甘油)进一步进行渗滤。渗滤系数为10-15，以确保纯化的重组腺病毒完全转移到产品的配液内，并保证产品的稳定性。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数被控制在5-10psi之间。用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液。对无菌散装药液取样，进行质检检测。无菌散装药液可以暂时存放在-80℃的冻箱内。合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。
将要瓶装的一批或多批无菌散装药液在室温下过夜融冻。再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。从无菌的装瓶药液取样用于质检检测后，用自动灌装机将无菌的装瓶药液按产品要求进行瓶装，加瓶塞和扎盖。灌装结束后，对重组腺病毒的制剂产品抽样进行质检检测。合格的产品由质保批准用于临床使用。
实施例
实施例1：生产重组腺病毒抗癌注射液产品过程
1.细胞扩增
取1只重组腺病毒工作细胞库的细胞。细胞量约5×106。细胞融化后接种到细胞培养用t型瓶内。接种密度约0.5×104至5×104/cm2。在37℃下在5％二氧化碳孵箱内培养至细胞密度达到约90％。用胰蛋白酶-edta将细胞脱壁收获。将收获的细胞接种到更多的t型瓶内来扩增细胞。接种密度依然保持在0.5×104到5×104/cm2。重复细胞扩增的操作，直到细胞量约1×109用于接种生物反应器。
2.celligen反应器细胞接种和病毒感染
2.1将2×109细胞接种到含有5升dmem+10％fbs细胞培养液的填充床生物反应器内进行培养。ph控制在6.5至8.2，do控制在15％至75％。培养液的温度通过水套中的循环水来自动控制在36至37℃。反应器的旋转搅拌桨提供培养液的搅拌。搅拌速度控制在50至200rpm。在细胞接种后第3天，开始灌注培养液，从而不断提供养分和排除细胞代谢有害副产品。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于0.5g/升。在生长5天后，可以进行重组腺病毒的感染。
2.2取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞。病毒感染复数控制在10至100vp/细胞。然后再培养7天。在病毒感染3至5天后，重组腺病毒会释放到培养液内。此时开始收获含有重组腺病毒的培养液，直到培养过程结束，收获病毒收集液35l，病毒量1.6×1015vp。每天收获的含有重组腺病毒的培养液暂时存放在4℃的冷库，最后汇总处理纯化。
3.重组腺病毒培养液初纯和精纯
首先将汇总收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质。再将滤清的收集液用另外一个300kdmwco的切向流超滤系统浓缩至3l，病毒总含量1×1015vp。将benzonasetm加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子。在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化benzonasetm处理过的重组腺病毒收集液。将阴离子交换树脂(lsepharoseqxl)装柱于bpg300的色谱柱内，装柱体积约2.5升。在使用色谱柱前，先对其进行hetp(heightequivalenttotheoreticalplate)检测，以保障色谱柱的性能是合格的。在装柱前，首先用1.0n的naoh溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的色谱柱进行消毒处理。处理后的色谱柱首先用a缓冲液(20mmtris,ph8.0)平衡。色谱柱平衡后，开始将重组腺病毒收集液装柱。装柱后，用5倍柱体积的a缓冲液清洗色谱柱直到uv吸收值到底线为止。紧接着用30倍柱体积的a缓冲液到b缓冲液(20mmtris,ph8.0,2mnacl)的线性nacl梯度来洗脱吸附在色谱柱上的重组腺病毒。在洗脱过程中unicorn软件通过对260nm的uv吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现。当260nm的uv吸收值升到0.1au时纯化的组腺病毒峰会被自动接收到消毒无菌的瓶子内。当260nm的uv吸收值降到0.2au时，停止接收，此时病毒液体积600ml，病毒浓度60×1010vp/ml，病毒纯度95％，病毒总量6×1014vp。之后，依次用碱液、缓冲液和酸液洗涤色谱柱和纯化系统。
4.产品配制和分装
然后用重组腺病毒产品的配液(20mmtris-hcl,ph8.0，含有10％的甘油)进一步进行渗滤。渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转移到产品的配液内，并保证产品的稳定性。用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液。对无菌散装药液取样24ml，进行无菌、细菌内毒素、病毒浓度等项目质检检测。无菌散装药液可以暂时存放在-80℃的冻箱内。合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。
将一批无菌散装药液在室温下过夜融冻。再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。从无菌的装瓶药液取样用于质检检测后，用自动灌装机将无菌的装瓶药液按产品要求进行瓶装，加瓶塞和扎盖。灌装结束后，对重组腺病毒的制剂产品抽样进行质检检测。检测项目包括：无菌，外观(淡白色液体，无肉眼可见异物)，内毒素＜10eu/支，采用培养法和荧光染色法检测支原体阴性，病毒浓度1×1012vp/支，病毒纯度≥95％，病毒活性≥3.3×1010iu/支，比活性≥3.3％，生物活性癌细胞tcid50：100至500moi，复制活性病毒＜1rca/3×1010vp，残留细胞蛋白质≤100ng/支，残留牛血清蛋白≤50ng/支，残留细胞dna≤10ng/支，残留benzonasetm≤1ng/支，无aav污染、异常毒性、不溶性微粒、渗透压摩尔浓度等。
实施例2：gmp大批量生产重组腺病毒抗癌注射液产品
1.细胞扩增
取1只重组腺病毒工作细胞库的细胞，细胞数量9.8×106。细胞融化后接种到细胞培养用t型瓶内。接种密度约5×104/cm2。在37℃下载5％二氧化碳孵箱内培养到细胞密度到约90％。用胰蛋白酶-edta将细胞脱壁收获。将收获的细胞接种到更多的t型瓶内来扩增细胞。接种密度依然保持在5×104/cm2。重复细胞扩增的操作，直到细胞量约2.5×109用于接种生物反应器。
2.celligen反应器细胞接种和病毒感染
2.1将2.5×109细胞接种到含有15升dmem+10％fbs细胞培养液的填充床生物反应器内进行培养。ph控制在6.5至8.2之间，do控制在15％至75％。培养液的温度通过水套中的循环水来自动控制在36至37℃之间。反应器的旋转搅拌桨提供培养液的搅拌。搅拌速度控制在50至200rpm之间。在细胞接种后第3天，开始培养液灌注，从而不断提供养分和排除细胞代谢有害副产品。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于0.5g/升。在生长9天后，可以进行重组腺病毒的感染。
2.2取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞。病毒感染复数控制在10至100vp/细胞之间。接着再培养6天。在病毒感染3至5天后，重组腺病毒会释放到培养液内。此时开始收获含有重组腺病毒的培养液，直到培养过程的结束，收获病毒收集液75l，病毒量3×1015vp。每天收获的含有重组腺病毒的培养液暂时存放在4℃的冷库，最后汇总处理纯化。
3.重组腺病毒培养液初纯和精纯
首先将汇总收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质。再将滤清的收集液用另外一个300kdmwco的切向流超滤系统浓缩至6l，病毒总含量2.7×1015vp。将benzonasetm加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子。在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化benzonasetm处理过的重组腺病毒收集液。将阴离子交换树脂(sepharoseqxl)装柱于bpg300的色谱柱内，装柱体积约2.5升。在使用色谱柱前，先对色谱柱进行hetp(heightequivalenttotheoreticalplate)检测，以保障色谱柱的性能是合格的。在装柱前，首先用1.0n的naoh溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的色谱柱进行消毒处理。处理后的色谱柱首先用a缓冲液(20mmtris,ph8.0)平衡。色谱柱平衡后，开始将重组腺病毒收集液装柱。装柱后，用5倍柱体积的a缓冲液清洗色谱柱直到uv吸收值到底线为止。紧接着用30倍柱体积的a缓冲液到b缓冲液(20mmtris,ph8.0,2mnacl)的线性nacl梯度来洗脱吸附在色谱柱上的重组腺病毒。在洗脱过程中unicorn软件通过对260nm的uv吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现。当260nm的uv吸收值升到0.1au时纯化的组腺病毒峰会被自动接收到消毒无菌的瓶子内。当260nm的uv吸收值降到0.2au时，停止接收，此时病毒液体积2500ml，病毒浓度90×1010vp/ml至95×1010vp/ml，病毒纯度95％，病毒总量2.2×1015vp。之后，依次用碱液、缓冲液、和酸液洗涤色谱柱和纯化系统。
4.产品配制和分装
然后用重组腺病毒产品的配液(20mmtris-hcl,ph8.0，含有10％的甘油)进一步进行渗滤。渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，并保证产品的稳定性。用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液。对无菌散装药液取样24ml，进行无菌、细菌内毒素、病毒浓度等项目质检检测。无菌散装药液可以暂时存放在-80℃的冻箱内。合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。
将一批无菌散装药液在室温下过夜融冻。再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。从无菌的装瓶药液取样用于质检检测后，用自动灌装机将无菌的装瓶药液按产品要求进行瓶装，加瓶塞和扎盖。灌装结束后，对重组腺病毒的制剂产品抽样进行质检检测。检测项目包括：无菌、外观(淡白色液体，无肉眼可见异物)，内毒素＜10eu/支，采用培养法和荧光染色法检测支原体阴性，病毒浓度1×1012vp/支，病毒纯度≥95％，病毒活性≥3.3×1010iu/支，比活性≥3.3％，生物活性癌细胞tcid50：100至500moi，复制活性病毒＜1rca/3×1010vp，残留细胞蛋白质≤100ng/支，残留牛血清蛋白≤50ng/支，残留细胞dna≤10ng/支，残留benzonasetm≤1ng/支，无aav污染、异常毒性、不溶性微粒、渗透压摩尔浓度等。