一种鼠抗人PD-1单克隆抗体及应用的制作方法

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种鼠抗人pd-1单克隆抗体及应用。

背景技术：

肿瘤免疫治疗近来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点。其中靶向免疫检查点正在成为最有希望的治疗癌症患者的方法之一。免疫检查点分子大都属于b7/cd28及tnf/tnfr超家族成员,是免疫共刺激或共抑制分子,通过实时协同调节淋巴细胞的活性进而影响机体的免疫应答。pd-1,也称为cd279,属于b7-cd28受体家族成员。pd-1是一个55kd的i型表面跨膜糖蛋白受体,由288个氨基酸组成。pd-1与其配体pd-l1或pd-l2结合,使得pd-1胞质区两个酪氨酸信号基序磷酸化,从而激活下游信号途径,最终破坏t细胞的糖代谢及il-2等信号因子的产生,使得t细胞丧失免疫功能。由此可见，阻断pd-1与其配体的相互作用可以提高肿瘤特异性t细胞的免疫活性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞，因此pd-1成为开发肿瘤免疫治疗药物的热门靶点。目前已有多种anti-pd-1/pd-l1抗体在肿瘤免疫治疗的临床研究迅速开展。例如pembrolizumab和nivolumab已被fda批准用于晚期黑色素瘤，nivolumab也已被美国fda批准用于晚期鳞状非小细胞肺癌的治疗。另外，mpdl3280a(anti-pd-l1单抗)，avelumab(anti-pd-l1单抗)等也已进入多个晚期临床研究中，覆盖非小细胞癌，黑色素瘤，膀胱癌等多个瘤种。然而临床试验的数据显示仅有部分患者对治疗产生响应。例如nivolumab是bms开发的pd-1药物。目前在开展的后期研究中，5个癌症组中仅有3组，治疗促进了肿瘤的缩小，包括72例肺癌患者中的18％，98例黑色素瘤患者中的不到三分之一和33例肾癌患者中的27％。lambrolizumab是默克公司研制pd-1抗体，其阶段性ib研究的结果显示在85例癌症患者中也仅有51％呈现客观的抗肿瘤反应，且只在9％的患者中出现完全的反应。

目前大部分患者对治疗无响应的机制尚不清楚，仍需要新的抗pd-1抗体，为治疗提供新的思路。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种新型鼠抗人pd-1单克隆抗体及其可变区序列，这类抗体与pd-1亲和力高，特异性强，其可变区序列可用于构建基因工程抗体。

本发明所采用的技术方案为：

本发明提供了一种鼠抗人pd-1单克隆抗体，其包含重链可变区序列和轻链可变区序列；

所述重链可变区序列的cdr区中包含三个如下序列：

gytftsntit(cdrh1、seqidno:1)

yinpnsdftnynekfrd(cdrh2、seqidno:2)

dyyggsyyamdy(cdrh3、seqidno:3)；

所述轻链可变区序列的cdr区中包含三个如下序列：

tadssvpssylh(cdrl1、seqidno:4)

stsnlas(cdrl2、seqidno:5)

hqyhrsplt(cdrl3、seqidno:6)。

具体地，本发明提供了一种鼠抗人pd-1单克隆抗体，其包含重链可变区序列和轻链可变区序列；其重链可变区序列为：(seqidno:7)

qvklqqsgaelarpgasvkmscmasgytftsntitwvkqrpgqglewigyinpnsdftnynekfrdkatltadrssstaymqlssltsedsavyycardyyggsyyamdywgqgtsvtvss

其轻链可变区序列为：(seqidno:8)

qivltqspaimsaslgervtmtctadssvpssylhwyqqkpgsspkfwiystsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrspltfgagtklelkra。

本发明还提供了保藏号为cgmccno.15697的鼠抗人pd-1的杂交瘤细胞株2f6。

本发明还提供了由保藏号为cgmccno.15697的鼠抗人pd-1的杂交瘤细胞株2f6产生的鼠抗人pd-1单克隆抗体。

本发明还提供了一种鼠抗人pd-1单克隆抗体的可变区序列，其包含重链可变区序列和轻链可变区序列；其重链可变区序列为：(seqidno:7)

qvklqqsgaelarpgasvkmscmasgytftsntitwvkqrpgqglewigyinpnsdftnynekfrdkatltadrssstaymqlssltsedsavyycardyyggsyyamdywgqgtsvtvss

其轻链可变区序列为：(seqidno:8)

qivltqspaimsaslgervtmtctadssvpssylhwyqqkpgsspkfwiystsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrspltfgagtklelkra。

本发明还提供了一种核苷酸分子，所述的核苷酸分子编码上述鼠抗人pd-1单克隆抗体。

所述的核苷酸分子编码鼠抗人pd-1单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列为：(seqidno:9)

caggtgaagcttcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcatggcttctggctacacttttactagtaacacgataacctgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctaacagtgattttactaattacaatgagaagttcagggacaaggccacattgactgcagacagatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagagattactacggtggttcctactatgctatggactactggggtcagggaacttcagtcaccgtctcctca；

所述的核苷酸分子编码鼠抗人pd-1单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列为：(seqidno:10)

caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcaccatgacctgcactgccgactcaagtgtaccttccagttacttgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaattctggatttatagtacatccaatctggcttctggagtcccaggtcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatcatcgttccccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaactgaaacgggct。

本发明还提供了上述鼠抗人pd-1单克隆抗体在检测pd-1蛋白试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物包括上述的鼠抗人pd-1单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明还提供了上述鼠抗人pd-1单克隆抗体在制备治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或抗免疫排斥的药物中的应用。

上述杂交瘤细胞株2f6的编号为cgmccno.15697，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2018年5月4日。

本发明所具有的有益效果：

本发明通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及rt-pcr法克隆ig可变区基因，共获得1株稳定分泌抗人pd-1抗体的杂交瘤及其可变区序列，并用流式细胞术、westernblot等方式对抗体结合特异性进行了鉴定。

本发明提供的鼠抗人pd-1单克隆抗体与人pd-1蛋白具有高亲和性，能以1.9x10^-8m的kd值与人pd-1结合。且结合特异性强，不与人ctla-4蛋白及人pd-1阴性的细胞(如raji细胞)产生交叉反应。能通过westernblot的方法特异性结合线性化人pd-1蛋白。基于这些特性这此单克隆抗体既可用于人pd-1蛋白的检测，也能够单独或与其它方法联合应用在肿瘤免疫治疗中，即能够有效运用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。

附图说明

图1为抗体2f6与sp2/0(hpd-1⁺)细胞的亲和常数分析图。

图2为：流式细胞术检测抗体2f6与pd-1家族成员ctla-4的交叉反应，检测细胞为过表达ctla-4的3t3细胞。

图2中依次为：左：阴性对照；中：ctla-4商品抗体，阳性对照；右：2f6。

图3为流式细胞术检测抗体2f6与raji(人pd-1阴性细胞)的交叉反应。

图3中依次为：左：阴性对照；中：pd-1商品抗体；右：2f6。

图4为facs检测抗体2f6与jurkat细胞(人pd-1阳性细胞)结合。

图5：westernblot法检测抗体与jurkat细胞总蛋白中人pd-1的结合特异性。上样顺序：左：marker；右：jurkat细胞总蛋白。

图6为facs法检测抗体2f6与商品anti-hpd-1抗体结合jurkat细胞表面hpd-1蛋白的竞争能力。

依次为：上1：阴性对照；上2：pd-1商品抗体2.5ul(阳性对照)

下1：2f6(1nm)+pd-1商品抗体2.5ul；

下2：2f6(10nm)+pd-1商品抗体2.5ul；

下3：2f6(100nm)+pd-1商品抗体2.5ul。

图7.facs法检测抗体2f6与激活后pbmc表面pd-1蛋白的特异性结合(左至右：同型对照，pd-1商品抗体，2f6)。

图8.ldh法检测抗体2f6对pbmc杀伤靶细胞能力的增强作用。

依次为：a：facs法检测pbmc激活前后pd-1表达变化：左，未激活pbmc；右，激活后pbmc。

b:facs法检测hepg2细胞经ifn-γ诱导前后，pd-l1表达变化：a，未诱导的hepg2细胞；b，ifn-γ诱导24h后的hepg2细胞。

c:2f6不同剂量组pbmc对hepg2细胞的杀伤率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

1.小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选

以人pd-1蛋白为免疫原，采用腹腔注射的方式免疫balb/c小鼠，分别在初次免疫后的第3周和第5周进行加强免疫，在加强免疫后的第8天取小鼠尾血，室温静置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，收集血清，以pbs稀释成不同浓度：1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1：12800。收集jurkat细胞，pbs洗1次，细胞计数，每个样品用1×10⁶个细胞，将100μl不同稀释度的血清加入到细胞中，阴性对照组以未免疫小鼠血清代替抗血清，4℃孵育1小时，pbs洗两次；加入pe标记大鼠抗小鼠igg抗体2μl，4℃避光孵育40分钟；细胞重悬于500μlpbs缓冲液中，流式细胞仪检测血清中抗体与细胞的结合百分率及荧光强度；以平均荧光强度为阴性对照两倍以上为有效效价，效价高于6400时，方可进行融合。融合前3天，对免疫小鼠通过尾静脉注射免疫原的方式进行冲击免疫。取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤sp2/0细胞进行细胞融合(以10：1比例)，融合时在37℃水浴的环境下，将50％的peg在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有hat的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x10⁷细胞/板)。在37℃、5％co2条件下培养细胞。

当融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液与2×10⁵个jurkat细胞共孵育，进行检测，方法与检测效价相同。平均免疫荧光强度为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/ml；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37℃、5％co2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株，向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，获得保藏号为cgmccno.15697的鼠抗人pd-1的杂交瘤细胞株2f6。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为2f6，为鼠源igg1亚型，轻链为κ链。

可变区序列：

抗体2f6:鼠源igg1型

重链：

qvklqqsgaelarpgasvkmscmasgytftsntitwvkqrpgqglewigyinpnsdftnynekfrdkatltadrssstaymqlssltsedsavyycardyyggsyyamdywgqgtsvtvss(seqidno:7)

cdrh1:gytftsntit(seqidno:1)

cdrh2:yinpnsdftnynekfrd(seqidno:2)

cdrh3:dyyggsyyamdy(seqidno:3)

轻链：

qivltqspaimsaslgervtmtctadssvpssylhwyqqkpgsspkfwiystsnlasgvpgrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrspltfgagtklelkra(seqidno:8)

cdrl1:tadssvpssylh(seqidno:4)

cdrl2:stsnlas(seqidno:5)

cdrl3:hqyhrsplt(seqidno:6)

2.腹水制备及纯化

无菌pbs溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x10⁶/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。以终浓度为33％的饱和硫酸铵对抗体进行粗纯，方法为取1份腹水加1份pbs,滴加1份饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃过夜，10000rpm离心10min除去上清，用少量pbs溶解沉淀，在4℃环境下用pbs透析除盐24h，期间换液3次。粗纯后的抗体按照ge公司提供的纯化手册，利用akta蛋白纯化系统，经1mlproteing纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。

3.单克隆抗体效价检测

pe直标2f6。标记后的抗体以终浓度400nm、200nm、100nm、50nm、25nm、12.5nm、6,25nm、3.2nm、1.6nm、0.8nm、0.4nm、0.2nm、0.1nm、0.05nm、0.025nm、0.0125nm、0.0061nm、0.003nm分别与2.5×10⁵sp2/0细胞(转染pd-1)室温共孵育30min，注意避光。1800rpm，10min离心，弃上清，pbs洗细胞，重复三次，将细胞重悬于400μl的pbs中，facs测定荧光强度，统计mean值。用数据分析软件graphpadprism5计算抗体的kd值。图1，为抗体2f6与sp2/0(hpd-1⁺)细胞的亲和常数分析图，抗体2f6的kd值为1.9x10^-8m。

4.rt-pcr法克隆ig可变区基因

1)总rna提取，单链cdna合成：

用trizol法(试剂盒购自invitrogen)提取2f6杂交瘤细胞株的的总rna,用m-mlv逆转录酶(购自invitrogen)将总rna逆转为cdna文库。

重链骨架区上游引物

p1：5’saggtgmagctkcassartcwgg3’(seqidno:11)

重链可变区下游引物

p2：5’tggggstgtygttttggctgmrgagacrgtga3’(seqidno:12)

轻链前导肽上游引物

p3：5’atggattttcaagtgcagattttcag3’(seqidno:13)

轻链可变区下游引物

p4：5’ggatacagttggtgcagcatcagcccgttt3’(seqidno:14)

配制pcr反应体系(50μl)如下：

cdna:2μl；上游引物(10μm):2μl；下游引物(10μm):2μl；dntpmixture:2μl；pfudna聚合酶(5u/μl):1μl；10xpfubufferⅱ:5μl；ddh2o:补足至50μl。反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分离并回收vl、vh片段。将回收后的vl、vh片段分别与pmd19-t(simple)载体(takara公司)进行连接，连接体系如下：vlpcr产物/vhpcr产物各70ng，pmd19-t(simple)载体1μl，solutioni连接反应液5μl；ddh2o补足至10μl，4℃连接过夜。连接产物转化入e.colidh5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液pcr鉴定，以对应抗体的cdna为阳性对照。配制反应体系(25μl)如下：菌液：1μl，上游引物(10μm)：1μl；下游引物(10μm)：1μl；dntpmixture(各2.5mm)2μl；taqdna聚合酶(5u/μl)：0.5μl；10×taqbuffer(mg2+plus)：2.5μl；补水至25μl。反应条件同前。选取菌pcr阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体2f6的重链、轻链可变区序列，符合典型抗体可变区序列特征。

5.与pd-1家族成员ctla-4的交叉反应性：将抗体以100nm的终浓度与2x10⁵个经ctla-4感染的3t3细胞(gfp阳性)进行孵育，以ctla-4商品抗体(购自bd)作为阳性对照。4℃孵育1小时，pbs洗两次；100ul重悬细胞，加入apc标记抗小鼠igg抗体1μl，4℃避光孵育40分钟；细胞重悬于500μlpbs缓冲液中，facs检测。结果见图2，可见抗体2f6与人ctla-4无交叉反应。

6.与人pd-1阴性细胞的交叉反应：

将抗体以100nm的终浓度与2x10⁵个raji细胞(pd-1阴性)进行孵育，以pd-1商品抗体作为对照。4℃孵育1小时，pbs洗两次；100ul重悬细胞，加入pe标记大鼠抗小鼠igg1抗体2μl，4℃避光孵育40分钟；细胞重悬于500μlpbs缓冲液中，facs检测。结果见图3。可见抗体2f6与raji细胞无交叉反应。

7.与高表达人pd-1的jurkat细胞特异性结合

1)facs检测抗体与jurkat表面pd-1蛋白结合：抗体以终浓度100nm、10nm、1nm、0.1nm分别与1×10⁶jurkat细胞进行孵育，室温孵育40min，pbs洗两次；100ul重悬细胞，加入pe标记大鼠抗小鼠igg1抗体2μl，室温避光孵育40分钟；细胞重悬于500μlpbs缓冲液中，facs检测。结果见图4：可见抗体2f6能有效结合jurkat细胞，亲和性强。

2)westernblot法检测抗体与jurkat细胞总蛋白中人pd-1的结合特异性。收集jurkat细胞，预冷pbs洗两遍，加入100μl预冷的ripa裂解液(强)和1μlpmsf(100mm)，转移至1.5mlep管内，冰浴，水平摇床震摇30分钟；4℃12,000rpm离心15分钟，收集上清，用bca法蛋白定量。以40ug/孔的蛋白量进行上样，经sds-page凝胶电泳、转膜后，将nc膜加入含5％脱脂奶(pbst配制)的封闭液中，室温封闭2小时。用5％脱脂奶将抗体2f6稀释为4μg/ml，封闭结束后加入稀释后的抗体，4℃轻摇孵育过夜。去除一抗，pbst洗3次，每次10分钟，室温温和摇动；用封闭液按1:3000比例稀释hrp偶联二抗(山羊抗鼠)，将二抗工作液滴加至nc膜中，室温温和摇动2小时；去除二抗，pbst洗3次，每次10分钟，室温温和摇动。使用ecl底物显色液、荧光/化学发光成像分析仪对nc膜进行曝光，结果如图5。每孔所上样品为等量的jurkat细胞总蛋白(40ug)；所用抗体孵育浓度均为4μg/ml。可见抗体2f6能特异性结合线性化后的人pd-1蛋白。无明显杂带，另一方面验证抗体与人pd-1结合的特异性。

8.facs法检测2f6与商品anti-hpd-1抗体的竞争关系。

将抗体2f6用pbs稀释至终浓度100nm、10nm、1nm,同时每孔加入2.5ul商品pd-1抗体(pe直标),不同稀释倍数的抗体2f6与商品抗体混匀后，与2×10⁵jurkat细胞室温避光孵育30min。1800rpm，10min离心，弃上清，pbs洗细胞，重复三次，将细胞重悬于400μl的pbs中，facs测定荧光强度，统计mean值。结果见图6：可见抗体2f6与商品anti-hpd-1抗体能产生完全竞争。

9.facs法检测抗体2f6与激活的pbmc的特异性结合

使用ficoll-hypaque从正常人富含血小板白膜中分离正常人外周血单个核细胞(pbmc)。pbmc经1μg/ml的激发型cd3抗体，及1μg/ml的cd28抗体激活24h后，将抗体2f6以终浓度10nm与1×10⁶pbmc细胞进行孵育，阳性对照组取商品pd-1抗体2μl与1×10⁶pbmc细胞进行孵育，终体积100μl，室温孵育40min，pbs洗两次；100μl重悬细胞，加入pe标记大鼠抗小鼠igg1抗体2μl，室温避光孵育40分钟；细胞重悬于500μlpbs缓冲液中，facs检测。结果见图7，可见2f6能有效识别激活后pbmc膜表面表达的pd-1蛋白。10.ldh法检测抗体2f6对pbmc杀伤靶细胞能力的增强作用

取对数生长期的hepg2细胞，计数后调整细胞密度至2×10⁵个/ml，接种于t75培养瓶，15ml/瓶，细胞贴壁后，添加ifn-γ至终浓度700单位/ml。37℃5％co2培养箱中常规培养24h。与此同时，激活pbmc，激活方法同实施方法9。分别取ifn-γ预处理24h后的hepg2，及激活24小时后的pbmc，流式细胞术检测pd-l1、pd-1的表达情况。结果见图8a，8b,可见经过处理后的hepg2，pbmc分别表达pd-l1、pd-1。

取ifn-γ诱导后的hepg2细胞，计数后调整细胞密度至1×10⁵个/ml，接种于96孔板，100ul/孔，置于37℃5％co2培养箱中常规培养。待hepg2细胞全部贴于孔底，吸弃培养基，以效靶比5:1的比例加入激活后的pbmc细胞悬液(200μl/孔)。每孔加入终浓度为150单位/mlil-2，相应实验孔分别加入终浓度为0μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml的2f6，每组设三个平行孔。按照说明书要求设计对照孔。250g离心4min以保证效靶细胞充分接触；置反应板于37℃5％co2培养箱中,效靶细胞共培养12小时。在获取上清前45分钟，加10μl裂解液至靶细胞最大释放孔及培养基体积对照孔中。裂解完成后，250g4min离心。收集上清，按照promegacytotox96非放射性细胞毒检测试剂盒说明测定ldh，计算杀伤率。结果见图8c，0μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml三个剂量组的杀伤率分别为18.07±3.60％，47.70±2.77％(p<0.05)，52.50±0.81％(p<0.001)。

可见抗体2f6在2.5μg/ml，5μg/ml剂量下，均能显著提高pbmc对hepg2细胞的杀伤水平。

序列表

<110>中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）

<120>一种鼠抗人pd-1单克隆抗体及应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>1

glytyrthrphethrserasnthrilethr

1510

<210>2

<211>17

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>2

tyrileasnproasnseraspphethrasntyrasnglulysphearg

151015

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<210>3

<211>12

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<213>鼠(musmusculus)

<400>3

asptyrtyrglyglysertyrtyralametasptyr

1510

<210>4

<211>12

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>4

thralaaspserservalprosersertyrleuhis

1510

<210>5

<211>7

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>5

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15

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>6

hisglntyrhisargserproleuthr

15

<210>7

<211>121

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>7

glnvallysleuglnglnserglyalagluleualaargproglyala

151015

servallysmetsercysmetalaserglytyrthrphethrserasn

202530

thrilethrtrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile

354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

glnglythrservalthrvalserser

115120

<210>8

<211>110

<212>prt

<213>鼠(musmusculus)

<400>8

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151015

gluargvalthrmetthrcysthralaaspserservalproserser

202530

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354045

iletyrserthrserasnleualaserglyvalproglyargpheser

505560

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65707580

alagluaspalaalathrtyrtyrcyshisglntyrhisargserpro

859095

leuthrpheglyalaglythrlysleugluleulysargala

100105110

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<211>363

<212>dna

<213>鼠(musmusculus)

<400>10

caggtgaagcttcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatg60

tcctgcatggcttctggctacacttttactagtaacacgataacctgggtaaaacagagg120

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<210>11

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<213>鼠(musmusculus)

<400>11

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<210>11

<211>23

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(0)..(23)

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<400>11

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<210>12

<211>32

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<222>(1)..(32)

<223>s=g或c；y=t/u或c；r=g或a；m=a或c.

<400>12

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

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<210>14

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

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