一种口蹄疫多型表位肽、疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种口蹄疫多型表位肽、疫苗及其应用。

背景技术

口蹄疫(fmd)是由口蹄疫病毒(fmdv)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，主要感染牛、猪和羊等多种家畜和野生哺乳动物，对畜牧产业和国民经济造成严重的损失。fmd已成世界性分布、虽然化学方法灭活的全病毒肽在fmd的预防和控制过程中发挥着中药的作用，但是，在肽应用实践中凸显出很多不足。如纯化病毒颗粒难度大，病毒株储存条件苛刻，肽接种免疫效果不稳定等。fmdv在血清学上分7个血清型，即a/o/c/sat/sat2/sat3和asiai，每一型又多个亚型。在我国目前同时存在a型、o型和asiai型。

目前口蹄疫基因工程亚单位肽又称生物合成亚单位肽或重组单位肽，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物-蛋白质或多肽制成肽。目前口蹄疫基因工程亚单位肽大多都是单价苗。由于各血清型之间的抗原性不同，此间又无交叉免疫现象，此单价苗的预防效果比较有限。虽然以fmdv-a/c为代表大的基因工程多价苗已经诞生，在膝鼠和牛体实验中获得了喜人的结果，其对插入基因表达产物的免疫原性不高，有部分动物可以抵抗强毒攻击，对动物免疫效果比传统肽低。

如何研制出高效、安全、抗原表达量高的嵌合多价亚单位肽仍然是科研工作者面临的主要问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种口蹄疫多型表位肽、疫苗及其应用。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种口蹄疫多型表位肽，所述肽是以瑞士乳杆菌s层蛋白(t-8)基因(其氨基酸序列为seqidno.9)为模板，设计引物，将o、a及asiai3型fmdv的vp1特定表位基因嵌入到所述s层蛋白自我组装区域，再连接表达载体pgex-4t-3，并转化到大肠杆菌bl21中进行表达，表达产物用sds-page鉴定，获得口蹄疫多型表位肽，其氨基酸序列为seqidno.10，核苷酸序列no.11。

作为优选，所述构建方法中设计的引物：

引物对1的上游引物核苷酸序列为seqidno.1，下游引物核苷酸序列为seqidno.2；

引物对2的上游引物核苷酸序列为seqidno.3，下游引物核苷酸序列为seqidno.4；

引物对3的上游引物核苷酸序列为seqidno.5，下游引物核苷酸序列为seqidno.6；

引物对4的上游引物核苷酸序列为seqidno.7，下游引物核苷酸序列为seqidno.8。

作为优选，所述口蹄疫多型表位肽的构建方法具体包括以下步骤：

(1)以所述s层蛋白(t-8)核酸为模板，通过所述引物对1进行pcr扩增得到扩增产物1；利用引物对2进行pcr扩增得到扩增产物2；将所述扩增产物1和所述扩增产物2的混合物作为模板，利用所述引物对1的上游引物和所述引物对2的下游引物作为新引物对进行pcr扩增得到扩增产物3；

(2)以所述s层蛋白(t-8)核酸为模板，通过所述引物对2的上游引物和所述引物对3的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物5；以所述扩增产物3为模板，利用所述引物对1的上游引物和所述引物对2的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物4；以所述扩增产物5和所述扩增产物4的混合物为模板，利用所述引物对1的上游引物和所述引物对3的下游引物作为新引物对进行pcr扩增得到扩增产物6；

(3)以所述s层蛋白(t-8)核酸为模板，利用所述引物对4进行pcr扩增得到扩增产物8；以所述扩增产物6为模板，利用所述引物对1的上游引物和所述引物对3的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物7；以所述扩增产物7和所述扩增产物8的混合物为模板，利用所述引物对1的上游引物和所述引物对4的下游引物作为新引物对进行pcr扩增得到扩增产物9，所述扩增产物9即为口蹄疫多型表位肽。

作为优选，所述扩增产物1和所述扩增产物2的混合摩尔比为1:1；所述扩增产物5和所述扩增产物4的混合摩尔比为1:1；所述扩增产物7和所述扩增产物8的混合摩尔比为1:1。

另一方面，本发明实施例提供了一种疫苗，所述疫苗包含上述口蹄疫多型表位肽。

再一方面，本发明实施例提供了上述口蹄疫多型表位肽在制备预防或治疗口蹄疫药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的口蹄疫多型表位肽是以瑞士乳杆菌s层蛋白(t-8)基因为模板，设计引物，将o、a及asiai3型fmdv的vp1特定表位基因嵌入到所述s层蛋白自我组装区域，再连接表达载体pgex-4t-3，并转化到大肠杆菌bl21中进行表达，表达产物用sds-page鉴定，最终获得口蹄疫多型表位肽。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的口蹄疫多型表位肽构建过程示意图；

图2是本发明实施例1提供的sds-page电泳图。

(其中，1:4t-3+fmdv诱导0小时；2:4t-3+fmdv诱导1小时；3:4t-3+fmdv诱导2小时；4:4t-3+fmdv诱导3小时；5:4t-3+fmdv诱导4小时；6:4t-3+fmdv诱导5小时；7:4t-3+fmdv诱导6小时；8：4t-3空载体未经诱导)

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1

以瑞士乳杆菌s层蛋白(t-8)基因(氨基酸序列为seqidno.9)为模板，设计引物，将o、a及asiai3型fmdv的vp1特定表位基因嵌入到所述s层蛋白原核表达载体pgex-4t-3中，并转化到大肠杆菌bl21中进行表达，表达产物用sds-page进行鉴定，最终获得口蹄疫多型表位肽，其氨基酸序列如seqidno.10，其核苷酸序列为seqidno.11；其中，设计引物为：

(atype)引物对1(pslp-f1)的上游引物核苷酸序列为seqidno.1，下游引物(pslp-r2)核苷酸序列为seqidno.1；

(otype)引物对2(pslp-f3)的上游引物核苷酸序列为seqidno.3，下游引物(pslp-r4)核苷酸序列为seqidno.4；

(asiai3type)引物对3的上游引物(npslp-f5)核苷酸序列为seqidno.5，下游引物(npslp-r6)核苷酸序列为seqidno.6；

引物对4的上游引物(npslp-f7)核苷酸序列为seqidno.7，下游引物(pslp-r8)核苷酸序列为seqidno.8。

具体构建步骤如下：

(1)以上述s层蛋白(t-8)核酸为模板，通过上述引物对1进行pcr扩增得到扩增产物1；利用引物对2进行pcr扩增得到扩增产物2；将上述扩增产物1和上述扩增产物2的混合物(摩尔比1:1)作为模板，利用上述引物对1的上游引物和上述引物对2的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物3；

(2)以上述s层蛋白(t-8)核酸为模板，通过上述引物对2的上游引物和上述引物对3的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物5；以上述扩增产物3为模板，利用上述引物对1的上游引物和上述引物对2的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物4；以上述扩增产物5和上述扩增产物4的混合物(摩尔比1:1)为模板，利用上述引物对1的上游引物和上述引物对3的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物6；

(3)以上述s层蛋白(t-8)核酸为模板，利用上述引物对4进行pcr扩增得到扩增产物8；以上述扩增产物6为模板，利用上述引物对1的上游引物和上述引物对3的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物7；以上述扩增产物7和上述扩增产物8的混合物(摩尔比1:1)为模板，利用上述引物对1的上游引物和上述引物对4的下游引物作为引物对进行pcr扩增得到扩增产物9，上述扩增产物9即为口蹄疫多型表位肽，经检测，其氨基酸序列为seqidno.10如下；构建过程如图1，电泳鉴定如图2所示。

注：上述划线部分为表位肽序列。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>内蒙古农业大学

<120>一种口蹄疫多型表位肽、疫苗及其应用

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