本发明属于新药研发合成技术领域，具体涉及一种抗艾滋病吲哚类化合物及其制备方法和其应用。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus；abbr:hiv)，即艾滋病(aids，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(lentivirus)，属逆转录病毒的一种。
人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质(matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(capsid)，衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的rna基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分(如trnalys3，作为逆转录的引物)。
hiv病毒的生命周期大致有五个阶段。第一阶段：当hiv病毒遇到宿主细胞时，hiv的外膜蛋白(gpl20)与靶细胞表面的cd4分子紧紧结合，导致gpl20分子内部的构相发生变化，使gpl20同时与靶细胞表面的辅助受体结合。在跨膜蛋白(gp41)的参与下，hiv的外膜与靶细胞膜发生膜的融合。随后，病毒核心部分被注入胞质内。第二阶段：在胞质内，hiv病毒的rna在反转录酶的作用下转录成一单链dna，并以此单链dna为模板.在dna聚合酶的作用下复制第2条dna链。第三阶段：这个双链dna经hiv整合酶整合进宿主的染色体组dna，形成“前病毒”。第四阶段：在一定条件的作用下该“前病毒”通过转录产生hiv病毒的rna和mrna，并被转移至胞质，hivmrna翻译产生新的hiv反转录酶、基因组rna、结构蛋白、调节蛋白、包膜糖蛋白等。第五阶段：装配成新的病毒体，以芽生的方式萌出细胞外，成为具有感染性的病毒颗粒。
根据hiv感染细胞的5个阶段特点，设计抗hiv化学药物的思路就非常清晰，可以划分为五类抑制剂：进入宿主细胞抑制剂，逆转录酶抑制剂，整合酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和装配及释放抑制剂。被fda批准及正在临床试验的进入宿主细胞抑制剂主要有恩夫韦地，马拉维若，vicriviroc，maraviroc，西夫韦肽等。逆转录酶抑制剂可分为两类：核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。核苷类逆转录酶抑制剂主要有齐多夫定，去羟肌苷，扎西他滨，司他夫定，阿巴卡韦，替诺福韦，恩曲他滨，elvucitabine，reverset等。非核苷类逆转录酶制剂主要有奈韦拉平，依非韦伦，地拉韦啶，依曲韦林，calanolidea等。目前整合酶抑制剂类的药物虽然非常少，只有merck公司的雷格特维被fda准用于hiv治疗，但是merck公司，葛兰素史克公司，吉利德科学公司等都有一批化合物在临床试验中，相信在不久的将来会出现一批整合酶抑制剂类的药物。当前上市的主要蛋白酶抑制剂有沙奎那韦，茚地那韦，利托那韦，奈非那韦，安普那韦，阿扎那韦，福沙那韦，洛匹那韦，替拉那韦，达如那韦等。
近些年来，hiv进入宿主细胞的过程成为药物研究的热点。进入过程涉及到病毒表面膜蛋白(gp120，gp41)与细胞表面受体以及辅助受体蛋白(主要是cd4、ccr5等)之间的相互作用。对于这些蛋白质分子结构以及作用机制的认识，为设计新型的抗hiv药物及疫苗提供了新的靶点。作用于gp41的多肽类药物t-20已经在2003年被美国fda批准上市，成为第一个商品化的hiv进入抑制剂。进入抑制剂作用于病毒生活周期的最初阶段，可用于对现有药物产生耐药性的艾滋病病人。进入抑制剂与逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂联合使用，将有助于提高药物的疗效，降低毒副作用，因此具有喜人的发展前景。
技术实现要素：
本发明提供了一种抗艾滋病吲哚类化合物及其制备方法和其应用，本发明以gp41n端螺旋口袋为靶点，根据对gp41与nb-2结合模式的研究结果，合成了一种新型进入宿主细胞抑制剂化合物，该化合物是一种新的小分子hiv-1融合酶抑制剂，能够抑制或阻止hiv融合，从而阻止hiv病毒rna进入宿主细胞。通过体外活性测试，本发明实施例具体得到的两种新型吲哚化合物式g(r1＝r2＝h，r3＝ome和r1＝r2＝h,r3＝cooh)具有较高的抗病毒活力且细胞毒性较小，细胞内抗hiv-1病毒活性ec50分别为0.81μm和0.78μm，细胞毒性cc50分别为16μm，16μm。
本发明的一个目的是提供一种如式g所示的化合物：
式g中，r1、r2、r3各自独立选自h、ome、cf3或cooh。
具体的，所述化合物包括下述1)-6)所述中的至少一种：
1)r1＝r2＝h，r3＝ome；
2)r1＝r2＝h,r3＝cooh；
3)r1＝r3＝h,r2＝ome；
4)r1＝r2＝r3＝h；
5)r1＝r3＝ome，r2＝h；
6)r1＝r2＝h，r3＝cf3。
本发明的另一个目的是提供一种化合物的制备方法，所述方法包括：
1)式a与式b所示的化合物反应后得式c所示化合物；
2)所述式c所示化合物与式d所示化合物反应后得式e所示化合物；
3)将所述式e所示化合物与式f所示化合物反应后即得目标产物式g所示化合物；
其中，式f所示化合物和/或式g所示化合物中，r1、r2、r3各自独立选自h、ome、cf3或cooh。
具体的，所述方法还包括下述1)-18)所述中的至少一种：
1)步骤1)中，所述反应包括通过弱碱催化剂催化所述反应；
2)步骤1)中，所述反应包括搅拌过夜反应；
3)步骤1)中，所述反应包括在室温下进行反应；
4)步骤1)中，所述反应包括在溶剂中反应；
5)步骤1)中，所述反应停止后，还包括萃取步骤；
6)步骤1)中，所述反应停止后，还包括纯化步骤；
7)步骤2)中，所述反应包括通过催化剂催化所述反应；
8)步骤2)中，所述反应包括在氩气的条件下进行反应；
9)步骤2)中，所述反应包括搅拌加热回流反应1小时以上；
10)步骤2)中，所述反应包括在溶剂中反应；
11)步骤2)中，所述反应停止后，还包括冷却、萃取和/或纯化步骤；
12)步骤3)中，所述反应前，还包括式e所示化合物的活化反应；
13)步骤3)中，所述反应包括搅拌过夜反应；
14)步骤3)中，所述反应包括在室温下进行反应；
15)步骤3)中，所述反应包括在溶剂中反应；
16)步骤3)中，所述反应停止后，还包括萃取步骤；
17)步骤3)中，所述反应停止后，还包括皂化反应、成盐反应和纯化步骤；
18)步骤3)中，所述式f所示化合物和/或式g所示化合物包括下述ⅰ)-ⅵ)所述中的至少一种：
ⅰ)r1＝r2＝h，r3＝ome；
ⅱ)r1＝r2＝h,r3＝cooh；
ⅲ)r1＝r3＝h,r2＝ome；
ⅳ)r1＝r2＝r3＝h；
ⅴ)r1＝r3＝ome，r2＝h；
ⅵ)r1＝r2＝h，r3＝cf3。
具体的，所述方法还包括下述1)-21)所述中的至少一种：
1)当步骤1)中，所述反应包括通过弱碱催化剂催化所述反应时，所述的弱碱催化剂包括碳酸钾、碳酸钠、醋酸钠、醋酸钾、吡啶、哌啶、或吡唑中的任意一种或几种；
优选的，所述的弱碱催化剂为碳酸钾；
2)当步骤1)中，所述反应包括通过弱碱催化剂催化所述反应时，所述的弱碱催化剂与式a或式b的摩尔比为5:1；
3)当步骤1)中，所述反应包括搅拌过夜反应时，所述的过夜反应为反应24h；
4)当步骤1)中，所述反应包括在溶剂中反应时，所述溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺；
5)当步骤1)中，所述反应停止后，还包括萃取步骤时，所述的萃取包括通过乙酸乙酯萃取；
6)当步骤1)中，所述反应停止后，还包括纯化步骤时，所述纯化包括硅胶层析纯化，硅胶层析的洗脱液为乙酸乙酯：正己烷＝15:85；
7)当步骤1)中，所述反应停止后，同时包括萃取步骤和纯化步骤时，所述纯化步骤在萃取步骤之后；
8)当步骤2)中，所述反应包括通过催化剂催化所述反应时，所述催化剂包括碳酸钾和/或pd(pph3)4；
9)当步骤2)中，所述反应包括通过催化剂催化所述反应时，所述催化剂包括pd(pph3)4，且所述pd(pph3)4与式c所示化合物的摩尔比为20:1；
10)当步骤2)中，所述反应包括搅拌加热回流反应1小时以上时，所述反应1小时以上为反应4小时；
11)当步骤2)中，所述反应包括在溶剂中反应时，所述溶剂包括四氢呋喃；
12)当步骤2)中，所述反应停止后，还包括萃取步骤时，所述的萃取包括在反应停止后的反应液中加入水后，通过乙酸乙酯萃取；
13)当步骤2)中，所述反应停止后，还包括冷却步骤时，所述冷却包括冷却至室温；
14)当步骤2)中，所述反应停止后，同时包括冷却、萃取和纯化步骤时，所述冷却、萃取和纯化步骤的顺序依次为冷却、萃取和纯化；
15)当步骤2)中，所述反应停止后，还包括纯化步骤时，所述纯化包括硅胶层析纯化，硅胶层析的洗脱液为乙酸乙酯：正己烷＝20:80；
16)当步骤3)中，所述反应前，还包括式e所示化合物的活化反应时，所述活化反应包括将式e所示化合物在0℃溶于无水dmf中，加入nah，混合加热至室温反应60分钟以上；
17)当步骤3)中，所述反应包括搅拌过夜反应时，所述的过夜反应为反应24h；
18)当步骤3)中，所述反应包括在溶剂中反应时，所述溶剂包括dmf；
19)当步骤3)中，所述反应停止后，还包括萃取步骤时，所述的萃取包括通过乙酸乙酯萃取；
20)当步骤3)中，所述反应停止后，还包括皂化反应、成盐反应和纯化步骤时，所述皂化反应包括加入naoh搅拌反应1小时以上，所述成盐反应包括用盐酸调节ph5.0以下，所述纯化包括通过乙酸乙酯萃取目标产物式g所示化合物；
再具体的，所述naoh为naoh浓度为4mol/l的naoh水溶液；所述盐酸为盐酸浓度为2mol/l的盐酸水溶液；所述用盐酸调节ph5.0以下为用盐酸调节ph3.0；
21)步骤3)中，所述式f所示化合物和/或式g所示化合物包括：r1＝r2＝h，r3＝ome或r1＝r2＝h,r3＝cooh。
本发明的再一个目的是提供本发明任一所述化合物、或本发明任一所述方法制备得到的化合物的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-5)所述中的至少一种：
1)在制备用于治疗艾滋病的药物及其相关产品中的应用；
2)抑制或阻止hiv病毒rna进入宿主细胞，且所述应用不包括疾病的诊断或治疗方法；
3)抑制或阻止hiv病毒表面膜蛋白gp41与宿主细胞表面受体或辅助受体蛋白nb-2的结合，且所述应用不包括疾病的诊断或治疗方法；
4)在制备用于抑制或阻止hiv病毒rna进入宿主细胞的产品及其相关产品中的应用；
5)在制备用于抑制或阻止hiv病毒表面膜蛋白gp41与宿主细胞表面受体或辅助受体蛋白nb-2的结合的产品及其相关产品中的应用。
本发明的还一个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括本发明任一所述的化合物、或本发明任一所述方法制备得到的化合物，以及药物上可接受的载体或助剂。
本发明的有益效果：
本发明合成了一种新型进入宿主细胞抑制剂化合物，该化合物是一种新的小分子hiv-1融合酶抑制剂，能够抑制或阻止hiv融合，从而阻止hiv病毒rna进入宿主细胞，可应用于制备抗艾滋病药物。通过体外活性测试，本发明实施例具体到的两种新型吲哚化合物式g(r1＝r2＝h，r3＝ome和r1＝r2＝h,r3＝cooh)具有较高的抗病毒活力且细胞毒性较小，细胞内抗hiv-1病毒活性ec50分别为0.81μm和0.78μm，细胞毒性cc50分别为16μm，16μm。
本发明实施例还具体提供了一种反应条件温和、原料易得、操作简便、路线简单、合成步骤少的合成路线，成功制备出本发明提供的具有高抗hiv-1活性的吲哚类化合物，可应用于制备抗艾滋病药物
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的化合物原料、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。
下述实施例中的式b化合物即3-溴乙基-苯甲酸甲酯、两个式f化合物公众均可购买得到。
实施例1、3-[1'-(3-甲氧基-苄基)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸的合成
本实施例提供了一种反应条件温和、操作简便的从6-溴-吲哚和3-溴乙基-苯甲酸甲酯经过三步催化反应直接制备具有高抗hiv-1活性的吲哚类化合物，合成路线如下所示：
(1)3-[(6-溴-1h-吲哚-1-基)-甲基]-苯甲酸甲酯的合成：
式a(382mg,1.95mmol)与式b(458mg,2mmol)所示的化合物在n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中在催化剂碳酸钾(1.38g，10mmol)作用下室温搅拌过夜反应24h，反应完全后通过乙酸乙酯萃取(每次30ml乙酸乙酯，萃取3次)，萃取后合并乙酸乙酯相，旋转蒸发浓缩乙酸乙酯相后通过硅胶层析纯化产物，用乙酸乙酯：正己烷＝15:85作为硅胶层析的洗脱液，获得中间产物式c所示的3-[(6-溴-1h-吲哚-1-基)-甲基]-苯甲酸甲酯。
1hnmrδ7.86(d,j＝7.6hz,1h),7.79(s,1h),7.41(d,j＝8.4hz,1h),7.31(s,1h),7.27(t,j＝8.0hz,1h),7.14-7.06(m,2h),7.00(d,j＝3.2hz,1h),6.45(d,j＝3.2hz,1h),5.20(s,2h),3.81(s,3h)；
13cnmrδ166.99,137.74,137.32,131.41,131.08,129.40,129.11,128.20,127.91,123.32,122.61,115.81,114.25,112.81,102.66,52.58,50.09。
(2)3-[1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸甲酯的合成：
步骤(1)中所获得的产物式c(516mg，1.5mmol)与吲哚-6-硼酸(式d)(247mg，1.7mmol)在四氢呋喃(15ml)中在催化剂和氩气的条件下搅拌加热回流反应4小时。反应完全后，混合物降至室温后加入20ml水，产物用乙酸乙酯提取(20ml×3)。乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥后浓缩，然后通过硅胶层析纯化产物，用乙酸乙酯：正己烷＝20:80作为硅胶层析的洗脱液，获得中间产物式e所示3-[1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸甲酯。
1hnmrδ8.19(br,1h),7.97(s,1h),7.93(d,j＝7.8hz,1h),7.68(dd,j＝12.8hz,j＝8.2hz,2h),7.58(s,1h),7.49(s,1h),7.44(d,j＝8.2hz,1h),7.39(d,j＝8.0hz,1h),7.34(t,j＝7.6hz,1h),7.25(br,1h),7.20(t,j＝2.4hz,1h),7.14(d,j＝3.0hz,1h),6.59(d,j＝3.0hz,1h),6.56(br,1h),5.40(s,2h),3.89(s,3h)；
13cnmrδ167.14,138.32,137.16，137.01,136.94,136.79,131.64,130.97,129.36,129.22,128.82,128.39,127.98,127.69,127.12,123.32,122.61,115.81,114.25,110.16,108.56,102.68,102.27,52.56,50.07。
(3)3-[1'-(3-甲氧基-苄基)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸的合成：
将步骤(2)所获得的产物式e(19mg，0.05mmol)在0℃溶于无水dmf(3ml)中，加入nah(15mg，60％)，混合加热至室温反应60分钟，反应完全后，反应混合物中加入式f(r1＝r2＝h,r3＝ome，10.5mg，0.052mmol)，室温条件下过夜搅拌反应24h。反应结束后加入10ml水，通过乙酸乙酯提取(15ml×3)，取乙酸乙酯相蒸干溶剂后，获得粗提物(22.5mg，90％)进行皂化反应(加入5ml4mol/lnaoh)，搅拌反应1小时，最后用2mol/l盐酸调ph3.0。反应结束后用乙酸乙酯提取(15ml×3)，取乙酸乙酯相浓缩获得8.5mg目标产物式g所示3-[1'-(3-甲氧基-苄基)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸。
目标产物3-[1'-(3-甲氧基-苄基)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸的表征数据如下：化学式为c32h26n2o3，486.2；ms负扫描485.1；
1hnmrδ7.82(d,j＝8.5hz,2h),7.68(d,j＝7.8hz,2h),7.60(t,j＝7.8hz,2h),7.52(d,j＝2.9hz,2h),7.46(m,2h),7.35(m,2h),7.20(t,j＝7.3hz,1h),6.78(m,3h),6.51(d,j＝2.8hz,1h),6.48(d,j＝2.8hz,1h),5.58(s,2h),5.45(s,2h),3.67(s,3h)。
实施例2、3-[1'-(3-苯甲酸)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸的合成
前两步即步骤(1)(2)和实施例1相同；
步骤(3)中式f(r1＝r2＝h,r3＝cooh，11.9mg，0.052mmol),其他条件和实施例1相同。最终得到目标产物式g所示3-[1'-(3-苯甲酸)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸15.5mg。
目标产物3-[1'-(3-苯甲酸)-1h,1'h-(6,6'-联吲哚)-1-基-甲基]苯甲酸的表征数据如下：
化学结构为c32h24n2o4；
1hnmrδ12.85(s,2h),7.82(br,4h),7.68(s,2h),7.60(d，j＝8.5hz,2h),7.52(s,2h),7.45(m,4h),7.36(d,j＝8.0hz,2h),6.51(s,2h),5.57(s,4h)；
13cnmrδ167.0,138.8,136.4,135.0,131.3,131.2,129.5,128.8,128.2,127.8,127.2,120.7,119.0,108.0,101.0,48.6。
实施例3、抗病毒活性实验
将dmso溶解的抑制剂用磷酸缓冲食盐水稀释，在37℃条件下将3×105个mt-2细胞预培养l小时，然后加入100μlhiv-1病毒稀释液，继续将细胞在37℃条件下培养1小时。洗涤3次后，将细胞分别悬浮于含有或不含有抑制剂的培养介质中，在5％co2，37℃条件下培养7天，并在第三天用含有或不含有抑制剂的培养介质替换补充培养液。对病毒的细胞病变作用每天用反向光学显微镜监控，在病毒感染第5天后发生细胞病变。向每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续培养4小时，弃去染色液，每孔加入dmso150μl，混合均匀，与酶标仪中590nm下记录吸光度值，计算出实施例1和实施例2合成的新化合物的ec50和cc50，所得结果如表1所示。
表1
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。