治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液。

背景技术：

骨坏死是指人体骨骼活组织成分坏死，祖国医学把骨坏死称之为骨蚀症。人体很多部位，仅就缺血性坏死已经发现40余处。临床研究证实，髋、膝关节骨坏死均呈阳性者，不论其他关节是否存在临床症状，均有肩、踝、腕、肘一个至数个关节多灶性骨坏死的风险。适宜的种子细胞是细胞治疗骨坏死技术关键所在，其应具有稳定可靠的来源，获取方法简单且增殖能力强。成体干细胞是细胞治疗的主要的种子细胞，其主要涉及胚胎干细胞和间充质干细胞。其中胚胎干细胞因涉及到伦理学，目前大部分国家禁止研究。间充质干细胞(mscs)成为目前研究的热点。mscs最早在骨髓中发现的，后来陆续在外周血、脐带血、脂肪、关节滑膜、骨骼肌、皮肤结缔组织等多种组织中发现，进一步研究证实其在一定条件下能向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞等转化，而且即使在20个或30个周期的细胞培养后，仍然保留干细胞特性。mscs具有自我更新能力，并能分化成各种组织和细胞，包括骨细胞和成骨细胞。mscs易于采集，另一个重要的好处是，即使是同种异体mscs，仍可诱导宿主较小的免疫反应，可以局部移植或系统治疗。

石墨烯量子点(gqds)是石墨烯材料的衍生物。石墨烯是一种单原子单层石墨，是由英国物理学家在2004年首次通过胶带微机械分离法制备的，是组成石墨材料的基本模块，可以被组成零维的富勒烯，亦可被制成三维的石墨或一维的碳纳米管。鉴于石墨烯在机械强度、比表面积、导电、导热、及力学性能等方面具有独特的优势，在最近十年来，石墨烯及其衍生物在生物医学领域得到前所未有的关注和研究。石墨稀具有高度的生物相容性，具有低毒性和大剂量的负载能力。石墨稀己经被证明适合细胞的生长，包括干细胞和原代神经细胞，且在体外，其生物相容性一般不影响细胞化长。石墨烯量子点(gqds)在兼顾了石墨烯优良特性的同时，又依靠量子限域效应和边界效应而具备了光致发光(pl)等石墨烯所不具备的性质，而且在细胞毒性、生物相容性等方面也有更好的表现。

骨形态发生蛋白(bmps)是一组具有诱导异位成骨能力的二聚体蛋白，属于转移生长因子-p超家族成员，是促进骨再生研究领域的主要细胞因子之一。bmp同源二聚体(如bmp2、bmp7)由于其过高的有效使用剂量而未能在临床普遍应用。bmp异源二聚体近年来被报道具有比相应同源二聚体更强的诱导骨形成作用，在细胞增殖、成骨分化以及细胞基质外矿化等环节中的具有较强生物学作用。bmp2/7异源二聚体在诱导细胞成骨发生的有效作用浓度低至5ng/ml，是相应同源二聚体的1/10，并于50ng/ml达到作用峰值平台期，其水平与相应同源二聚体在高浓度时获得的最高作用水平无显著性差异。该特点使得bmp2/7有替代bmp2和bmp7应用于临床的潜力，并且符合生理规律的低水平缓慢释放能使bmp2/7在诱导成骨发生过程中发挥最佳效果。bmp2/7异源二聚体在诱导细胞破骨发生的过程中，在5-200ng/ml浓度范围内基本呈现浓度依赖效应递增趋势，在高浓度时诱导破骨发生的最大作用效果稍低或接近于bmp2同源二聚体。当bmp2/7低剂量应用时，仅能最小程度地刺激细胞破骨发生，因此在促进成骨发生的同时并不会带来显著的破骨吸收。

立足骨坏死复杂的病理生理学改变，本发明采用石墨烯量子点、bmp2/7异源二聚体和间充质干细胞按一定量混合制成的混悬液，既为骨坏死修复提供良好种子细胞来源，又激发骨髓间充质干细胞成骨活性及促进成骨细胞成骨、抑制破骨细胞破骨，促进骨坏死修复。

技术实现要素：

本发明公开了一种治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液及其制备和使用方法。采用石墨烯量子点、bmp2/7异源二聚体和间充质干细胞制成的混悬液，既为骨坏死修复提供良好种子细胞，又激发骨髓间充质干细胞成骨活性及促进成骨细胞成骨、抑制破骨细胞破骨，恢复骨代谢平衡。

本发明公开了治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液及其制备方法，其流程包括：无菌条件下取新鲜骨组织，dmem(dulbecco′smodifiedeaglemedium)培养基充分冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，贴壁法分离培养骨髓间充质骨细胞，胰蛋白酶消化细胞后，使用标准培养基制成细胞悬浮液，添加终浓度为110～250μg/ml的石墨烯量子点和终浓度为5-50ng/mlbmp2/7异源二聚体，调节ph在7.35～7.45。

作为优选的技术方案：

其中，如上所述治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液的制备方法，其特征是所述dmem培养基含10％胎牛血清、100μ/ml青霉素和100u/ml链霉素。

如上所述治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液的制备方法，其特征是所述的胰蛋白酶浓度为0.25％。

如上所述治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液的制备方法，其特征是所述的细胞悬浮液细胞密度为1000～8000/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用石墨烯量子点、bmp2/7异源二聚体和间充质干细胞制成的混悬液，直接作用于骨坏死局部，既为骨坏死修复提供良好种子细胞，又激发骨髓间充质干细胞成骨活性及促进成骨细胞成骨、抑制破骨细胞破骨，三者结合各取其长、优势互补，利于骨坏死的修复。

附图说明

图1是采用本发明治疗股骨头坏死。

图2是未采用本发明治疗股骨头坏死。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例：

采用颈椎脱白法处死sd大鼠后，将其浸泡于75％酒精中20分钟充分消毒，无菌条件下取胫骨和股骨，并剔除骨上附巧的软骨组织及骨骺端，充分暴露骨髓腔。将分离的胫骨和股骨移入另一无菌平皿，用5ml针管抽取含10％胎牛血清、100μ/ml青霉素和100u/ml链霉素的dmem培养基充分冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液。依次使用150目筛网、200目筛网过滤2次，400×g离心、20min，小心吸去上清液，使用无血清dmem清洗1次(400×g离心、10min)，使用标准培养基，重悬细胞，调整最终浓度为5×10⁶/ml，接种于25cm²培养瓶中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。72h后换液，吸出旧培养液，去除未贴壁细胞，重新加入新鲜培养液，每3天更换一次培养液。当细胞贴壁融合后，采用pbs溶液冲洗，0.25％胰蛋白酶溶液消化，标准培养基制成细胞悬浮液，细胞密度为8000/ml，添加石墨烯量子点和bmp2/7异源二聚体使其终浓度分别为110μg/ml和50ng/ml，调节ph在7.35～7.45。

为说明治疗骨坏死的骨髓间充干细胞混悬液在治疗股骨头坏死时的使用方法，以sd大鼠股骨头坏死为例，详加说明：肌肉注射甲强龙，拍摄髋关节mri及行股骨头病理检查，确定股骨头坏死。夹固定于侧卧位，选择后外侧入路，钝性剥离髋关节肌群，至股骨大粗隆。在x光机导引下，选用直径1.5mm钻头在大粗隆下钻方钻入关节软骨下，且未突破关节软骨，钻直径为1.5mm的骨道，摆动大腿姿势使骨道与地面垂直。用1ml注射器配10ml注射器针头，将针头刺入骨道底部，注入细胞混悬液，0.2ml/min边注射边后退，不溢出骨道为度，骨蜡封闭骨道外口。生理盐水反复冲洗，关闭创口，术后青霉素预防感染。四环素-钙黄绿素标记法，9周后检测股骨头新生骨(见图1，2)，发现采用本发明后骨小梁周围的新骨生成速率明显增加，提示骨坏死修复明显。