一种生产L-木糖的重组变形假单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种生产l-木糖的重组变形假单胞菌及其应用，属于生物工程
技术领域：
。
背景技术：
木糖是一种五碳糖，l-木糖主要存在于植物和动物体内。木糖属于无热量甜味剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域。食用木糖能改善人体的微生物环境，提高机体免疫能力，是糖尿病人理想的甜味剂。目前制备木糖均采用酸法提取，酸法生产木糖多采用硫酸进行水解，但酸法生产木糖有如下缺点：①生产过程中采用大量硫酸，硫酸使原料中的纤维素和半纤维素及其它糖类物质水解，产生多种副产物，影响后提取工艺和产品质量。②酸法提取木糖由于生产过程中加入大量强酸强碱液体，生产过程中产生大量生产废液，对环境造成了巨大污染。③由于酸水解的糖液杂质多，使得后处理效率低，化工程序多，对设备要求高，增加环保成本。目前，l-木糖的生产主要是由化学合成的方法，存在上述的不利因素。l-木糖也可由l-木酮糖转化生成，但是l-木酮糖属于稀有糖，价格较高，不宜作为生产l-木糖的原料。变形假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌。假单胞菌中葡萄糖的代谢是通过ed途径(entner-doudoroffpathway)完成的，在好氧条件下，葡萄糖在周质空间被氧化为葡萄糖酸，研究表明，在假单胞菌中大多数由葡萄糖产生的葡萄糖酸(约90％)被转化为2-酮基葡萄糖酸(2kga)。目前，变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)是国内2kga生产的主要工业用菌。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种生产l-木糖的重组菌，是以变形假单胞菌为宿主，利用双质粒表达系统表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因。在本发明的一种实施方式中，所述双质粒表达系统包括pme6032质粒和pbbr1mcs-2质粒。在本发明的一种实施方式中，所述pme6032质粒用于表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因。在本发明的一种实施方式中，所述pbbr1mcs-2质粒用于表达2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因。在本发明的一种实施方式中，所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2gadh由三个亚基组成，分别表示为2gadh-1，2gadh-2，2gadh-3，其序列分别以seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示，以pme6032质粒为载体，在变形假单胞菌中表达seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示基因2gadh的三个亚基。在本发明的一种实施方式中，所述2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因2,5dkg来自corynebateriumatcc31090。在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因pdc来自saccharomycescerevisiae。在本发明的一种实施方式中，所述变形假单胞菌宿主包括pseudomonasplecoglossicidacgmcc7150、pseudomonasplecoglossicidacgmcc1.16111、pseudomonasplecoglossicidacgmcc1.12685、pseudomonasplecoglossicidacgmcc1.761中的任一种。本发明的第二个目的是提供一种生产l-木糖的重组变形假单胞菌的构建方法，所述构建方法的具体步骤为：(1)通过化学合成seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示基因，将上述序列同时与载体pme6032连接形成重组质粒pme6032-2gadh；(2)将上述重组质粒pme6032-2gadh转化至变形假单胞菌中得到重组变形假单胞菌；(3)分别扩增2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因，将上述序列同时与载体pbbr1mcs-2连接形成重组质粒pbbr1mcs-2-25dkg-pdc；(4)再将步骤(3)所得的重组质粒pbbr1mcs-2-25dkg-pdc转化至含有重组质粒pme6032-2gadh的变形假单胞菌中得到含有双质粒的重组菌。本发明的第三个目的是提供所述变形假单胞菌在生产l-木糖中的应用，将所述重组菌培养至od650为0.6-0.8，加入iptg诱导2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的表达，以葡萄糖为底物合成l-木糖。进一步得，所述应用中的种子培养基：葡萄糖14.0-15.0g/l，玉米浆3.5-4.0g/l，尿素1.5-2.5g/l，kh2po41.5-2.5g/l，mgs04·7h2o0.4-0.6g/l，caco30.8-1.2g/l，ph值7.0；所述应用中的发酵培养基：葡萄糖75.0-85.0g/l，玉米浆3.0-4.0g/l，尿素1.5-2.5g/l，kh2po41.5-2.5g/l，mgso4·7h2o0.4-0.6g/l，caco39.0-11.0g/l，ph值6.8。本发明取得有益效果：(1)变形假单胞菌是国内2-酮基葡萄糖酸(2kga)生产的主要工业用菌，在工业生产中可达到较高的糖酸转化率，采用本发明的方法，可以将2-酮基葡萄糖酸在2-酮基葡萄糖酸脱氢酶、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶和丙酮酸脱羧酶的催化下生成l-木糖，为l-木糖的生产提供了新的原料和方法。(2)本发明使用发酵法生产l-木糖的过程工艺操作简单，不会给环境带来污染，以葡萄糖为底物，摇瓶上发酵56h，l-木糖的产量可达16.2g/l，转化率达到了20.3％，在3l和15l发酵罐上分别发酵48h和44h，l-木糖的产量分别可达37.6g/l和45.8g/l，葡萄糖转化率分别为47.0％和57.3％。(3)本发明方法可直接用于酵母菌的生物转化实验，生产木糖醇，此种方法不需要脱毒，发酵性能好，利于木糖转化为木糖醇。因此，本发明制备l-木糖的方法为以后绿色工业化生产奠定基础。附图说明图1所示为重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的摇瓶发酵结果。图2所示为重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的3l罐分批发酵结果。图3所示为重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的15l罐分批发酵结果。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。l-木糖浓度通过高效液相色谱法测定。高效液相色谱条件：色谱柱为hpx-87h(bio-radhercules)，柱温35℃；检测器为示差折光检测器；流动相为5mmh2so4，流速为0.6ml/min。发酵上清液通过0.22μm微孔过滤除去杂质后直接用于l-木糖的检测。葡萄糖浓度通过国产sba-40c生物传感分析仪测定。葡萄糖转化率的计算方法：氨糖总量/总耗糖量×100％。2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2gadh亚基1序列如seqidno.1所示；2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2gadh亚基2序列如seqidno.2所示；2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2gadh亚基3序列如seqidno.3所示；引物如表1所示，表1相关引物实施例1(1)重组质粒pme6032-2gadh的构建及鉴定通过化学合成获得序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示序列，设计引物(2gadh-1、2gadh-2、2gadh-3，见表1)，将以上2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因(2gadh)的3个亚基的基因以酶切位点ecori、saci、kpni、ncoi依次在pme6032质粒16℃过夜连接，连接产物pme6032-gadh化学法转化至大肠杆菌jm109感受态细胞。将转化液涂布于含50mg/l四环素的lb平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。(2)重组菌株p.plecoglossicida-2gadh的构建将(1)中构建完成的质粒pme6032-2gadh通过电转化的方法转入出发菌株pseudomonas.plecoglossicidacgmcc7150中，通过四环素筛选得到阳性菌株p.plecoglossicida-2gadh。(3)重组质粒pbbr1mcs-2-25dkg-pdc的构建及鉴定分别以corynebateriumatcc31090和saccharomycescerevisiae基因组为模板，设计引物(2,5dkg、pdc，见表1)，扩增2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因(2,5dkg)和丙酮酸脱羧酶基因(pdc)，将2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因以酶切位点kpni、ecori、bamhi依次在pbbr1mcs-2质粒16℃过夜连接，连接产物pbbr1mcs-2-25dkg-pdc化学法转化至大肠杆菌jm109感受态细胞。将转化液涂布于含50mg/l卡纳霉素的lb平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。(4)重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的构建将(3)中构建完成的质粒pbbr1mcs-2-25dkg-pdc通过电转化的方法转入(2)中得到的菌株p.plecoglossicida-2gadh中，通过氨苄青霉素筛选得到阳性菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc。实施例2出发菌株为pseudomonasplecoglossicidacgmcc1.12685，其余步骤与实施例1相同，筛选得到阳性重组菌株p.plecoglossicida1-2gadh-25dkg-pdc。实施例3重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的培养及l-木糖发酵种子培养基：葡萄糖15.0g/l，玉米浆4.0g/l，尿素2.0g/l，kh2po42.0g/l，mgs04·7h2o0.5g/l，caco31.0g/l，ph值7.0。发酵培养基：葡萄糖80.0g/l，玉米浆4.0g/l，尿素2.0g/l，kh2po42.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，caco310.0g/l，ph值6.8。摇瓶培养：取适量菌(实施例1中所得)悬液接种于装有50ml种子培养基的500ml摇瓶中，于30℃，220r/min条件下培养16-20h，以10％的接种量转移至加有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，于30℃、220r/min条件下培养至od650为0.6时，采用iptg进行诱导，终浓度为0.5mm。诱导温度为25℃，发酵至64h，定期取样。测定l-木糖的产量，结果如图1所示，发酵56h时，重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc生产l-木糖的总量达到最大值，为16.2g/l，葡萄糖转化率为20.3％。实施例4重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的3l发酵罐发酵3l罐上发酵培养基及条件如下：发酵培养基：葡萄糖80.0g/l，玉米浆4.0g/l，尿素2.0g/l，kh2po42.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，caco310.0g/l，ph值6.8。发酵条件：初始装液量为2.0l，种子接种量为10％，初始发酵条件为：培养温度为30℃，ph为6.8，搅拌速度为400rpm，通气量为1.5vvm，当菌体od650为0.6时，采用iptg进行诱导，终浓度为0.5mm，诱导温度为25℃，发酵至64h，定期取样。测定l-木糖的产量，结果如图2所示，发酵48h时，重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc生产l-木糖的总量达到最大值，为37.6g/l，葡萄糖转化率为47.0％。实施例5重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的15l发酵罐发酵15l罐上发酵培养基及条件如下：发酵培养基：葡萄糖80.0g/l，玉米浆4.0g/l，尿素2.0g/l，kh2po42.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，caco310.0g/l，ph值6.8。发酵条件：初始装液量为10.0l，种子接种量为10％，初始发酵条件为：培养温度为30℃，ph为6.8，搅拌速度为400rpm，通气量为0.8vvm，罐压0.5bar，当菌体od650为0.6时，采用iptg进行诱导，终浓度为0.5mm，诱导温度为25℃，发酵至64h，定期取样。测定l-木糖的产量，结果如图3所示，发酵44h时，重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc生产l-木糖的总量达到最大值，为45.8g/l，葡萄糖转化率为57.3％。对比例1采用pme6032单质粒表达构建重组菌采用实施例1的策略，将2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因(2gadh)的3个亚基的基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因以酶切位点ecori、saci、kpni、ncoi、bgiii、xhoi依次与pme6032质粒连接，构建完成的质粒pme6032-2gadh-25dkg-pdc表达在p.plecoglossicidacgmcc7150中，结果显示，无法成功表达。对比例2采用pbbr1mcs单质粒表达构建重组菌采用实施例1的策略，将2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因(2gadh)的3个亚基的基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因以酶切位点kpni、xhoi、hindiii、ecori、bamhi、saci依次与pbbr1mcs质粒连接，构建完成的质粒pbbr1mcs-2gadh-25dkg-pdc表达在p.plecoglossicidacgmcc7150中，结果显示，无法成功表达。对比例3：采用来源于欧文氏菌的2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因(2gadh)出发菌株为p.plecoglossicidacgmcc7150，步骤与实施例1相同，发现来源于欧文氏菌的2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因(2gadh)在宿主菌株中不能成功表达。对比例4：重组菌株p.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc发酵培养基调整具体实施方式同实施例3，区别在于发酵培养基中葡萄糖、玉米浆他尿素的浓度分别如下表1所示，结果显示当葡萄糖、玉米浆和尿素浓度分别为80.0g/l、4.0g/l和2.0g/l时，l-木糖产量和转化率可达到相对较高，分别为16.2g/l和20.3％。表1发酵培养基的成分调整及对应产量和转化率编号葡萄糖(g/l)玉米浆(g/l)尿素(g/l)l-木糖(g/l)转化率(100％)170.04.02.012.017.1280.04.02.016.220.3390.04.02.016.418.2480.02.02.013.515.9580.05.02.014.017.5680.04.01.013.416.8780.04.03.013.016.3虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>上海凌凯医药科技有限公司<120>一种生产l-木糖的重组变形假单胞菌及其应用<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>567<212>dna<213>人工序列<400>1atgaacctgaaaatcgaaccggatgttatcttcagcccgaaaaacggcaccggtagcacc60cgtcgtgaatttctgctggcaactgctcgtttaaccctggctggtgcgttcgcatctctg120tctggtaatgcattcgctgcttctgttgcgcgtgcttctgatccggttaccgcatttatc180gctctgtctcgtactatcaccgaacacaaacagattgattctgttttagcagcgcgtttc240tttgatgcattcgcggctcgtgataaacacttcgcagctcgtctgtctcatctggctcag300ctgcagtctccggatgattctgcgcagcagctgctgaacaaagcgacccaggctggtctg360catgattttctgtatcagatcgttgttgcttggtataccggtaccgttggtgatgattac420cacggtaccctggttgcttataaacaggctttaatgtatcagaccgtttctgatggcctg480attgttccgacctattgtggtaacggtccgatctggtggactgctccggttccggctgaa540aacccgtctctgattgaaaacctgtaa567<210>2<211>1656<212>dna<213>人工序列<400>2atgaaaaaaccggttttcaccgcgcagggtgatgctagcgcggatattgttatcgtgggc60tctggtatcgttggcggtatgatggcaaacgaactggtttctcagggctattctgtgctg120gttctggaagcgggtctgcgtatcgatcgcgcccaggccgttgaaaactggcgtaacatg180ccgtttgcgaaccgtgcaggcagcgatttccagggtctgtatccgcagtccaaattcgcg240ccggcgccgctgtacttcccacgtaacaactacgttaacgttaccggcccgaacgcggat300tccttccagcagggttacctgcgtaccgttggtggtaccacgtggcactgggcggcgagc360tgctggcgtcaccacccgagcgatttcgtgatgcagtccaaatacggtgttggtcgtgat420tggccaatcggctatgatgaactggaaccgtggtactgcaaagcagaaaacgaaatcggt480gttgctggcccgaacgacccggcgcgtcagagcccgaccgaacgtagccagccgtatccg540atggatatggtgccgttcgcacacggtgataactacttcgcgtccgttgttaacccgcat600ggctacaacctggttccgattccgcagggccgttccacccgtccgtgggaaggtcgtccg660acctgctgcggcaacaacaactgtcagccgatctgtccgatcggtgcgatgtacaacggt720atccaccacgttgaacgtgcggaacgtaacggcgcggtggtgctggcagaagctgttgtt780tacaagatggataccgattccaacaaccgtattaccgctgtacactggctggacaccagt840ggcgcaagccacaaagccaccgctaaagcgtttgcgctggcgtgtaacggtatcgaaacc900ccgcgtctgctgctgatggctgcgaacgatgcgaacccgaacggcattgccaacgcgagc960gatatggttggccgtaatatgatggaccatagcggttttcactgtagcttcctgaccaaa1020gagccggtttggctgggtaaaggtccggcgcagtcttcctgcatggtgggctaccgtgac1080ggtgatttccgtcgtgattacagcgcaaacaaagttatcctgaacaacatctctcgtgtt1140gttaccgcgacccaacaggccatgaaaaaaggtctggttggcaaagctctggatgaagaa1200atccgttatcgtgcggttcacagcgtggatctgtccatctctctggaaccgctgccggac1260ccggaaaaccgtctgaccctgtctaaaacccgtaaagatccgcacggcctgccgtgcccg1320gacatctactacgatgttggtgactacgttcgtaaaggtgcggaagcgtcccatgcgcag1380ctggaacatatcggccagctgtttgatgcgaaagagtttaccatttctcagggtctgaac1440gctaacaaccacattatgggtggtgttatcatgggcaaaaacgcaaaagaagcggttgtt1500gatggtaactgtcgtgcgttcgatcacgaaaacctgtggctgccgggtggtggcgcgatc1560ccgtctgcttctgtggttaacagcaccctgactatggcggcgctgggtctgaaagcggct1620cacgatatcagcctgcgtatgaaaggtgatgcatga1656<210>3<211>1413<212>dna<213>人工序列<400>3atgaaacagctgctgatggcaaccagcctgatggctgctctgaccctgtctgctccggca60gaacagactgacctgaccctgttgcgccagggcgaacaagtcgccattgcttccgattgt120caggcatgccacaccgcgccgggtagcgcgaccgcgttctccggtggctacgcgatcgcg180tccccgatgggcgtgatctactctaccaatatcaccccgagcgcggatggtatcggcccg240tactctgaagcggaattttcccaggcggtgcgtcacggcgtgcgtgcggatggcgcgcag300ctgtacccggcgatgccgtacacctcttatagcaaaatcactgacgaagatctgcatgct360ctgtactactacttcatgcacggcgttaaaccggtggaacagaaaaaccgccagaccagc420ctgccgttcccgttcaacctgcgtttctccatgttcttctggaacctgatgttcgcggat480gataaaccgtacctgagcgatgatagccagtctgctgaatggaaccgtggtaactacctg540gtgaacggcctggcgcactgcaacacctgccacaccccgcgtggcgttctgatgcaggaa600gcaggtaaccgcccgctggcgggtgcgccgattggtagctggtacgctccgaacattacc660tccgatgcgatcagcggcatcggtggttggcgtaacgatgaactggtgcagtacctgaaa720accggccgtgcggaaggtaaaaaccaggcggcaggtggtatggcggaagcggttgaacac780tctctgcagtacctgagcgatagcgatctgaaagcgattgcggtttatctgaaaagcacc840accccgattcgtgatgaaggtgatacccagccggcgtactccttcggtaaaccggcggat900gttgaaaacagcatccgcggtcgtaacgccaacaacgctaaccactctctgaccaacggt960gctgcgctgttctctggcaactgcgcgtcttgccaccagccggatggcgcgggctctgca1020aatcaggcgtatccgtctctgttccacaacaccgccaccggcatgcataacccggcgaac1080ctgattgcggcgatcctgttcggcgttcagcgtaacaccgctgcgggccaggtcctgatg1140ccgggatttagtagcccatcttacgtagataaattgagtgacgcacaggtagcagacatt1200agtaatttcgttctggcgcactatggtaacccggaagttaccg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