一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种固定化木质素过氧化物酶的制备方法及其在处理废水中有机污染物方面的应用，属于废水中有机污染物处理技术领域。

背景技术

工业和畜禽养殖废水中主要的有机污染物有酚类化合物、苯类化合物、卤烃类化合物和抗生素等。这些有机污染物毒性大且不容易被环境中的微生物降解。目前，处理废水中的有机污染物的方法主要有化学法、物理法和生物法等。其中物理方法一般设备较为昂贵，处理的条件要求高；化学法在处理的过程中见效快，周期短，但容易产生二次污染；生物法则需要大量培养微生物，周期较长且废水中的污染物对微生物的生长产生危害。

酶是被广泛应用于医药、食品和环保等领域的绿色催化剂，具有反应条件温和、反应速度快和副产物少的特点。近年来，利用酶去除废水中的有机污染物成为污水处理技术领域的一个热点。但是游离酶具有稳定性较差、对外界环境因素非常敏感、价格高和反应后并不能回收等缺陷，因此限制了酶在各个领域的应用。而将游离生物酶与固定化载体结合后，具有更宽的温度和酸碱耐受范围，酶的稳定性和可操作性加强。

关于固定化漆酶处理废水中的有机污染物的研究比较广泛。固定化漆酶能够直接催化降解酚类化合物，但是因为漆酶的氧化还原电势比较低，催化降解非酚型化合物则需要一些低氧化还原势的化合物作为高效介体。然而，高效介体多为人工合成，价格昂贵且存在潜在的环境毒性。木质素过氧化物酶(ec1.11.1.14)是含亚铁血红素的过氧化物酶，具有较广泛的底物专一性，且仅在过氧化氢的存在下，就可催化降解苯酚、芳香胺、多环芳香化合物等多种有机污染物。相比于高效介体，过氧化氢的价格低廉，且不会产生毒性。因此，固定化木质素过氧化物酶处理废水中有机污染物具有极其广阔的工业研究与应用前景。

目前，酶固定化载体的材料主要有壳聚糖、生物炭、硅胶和大孔树脂等，但是现有的固定化材料与酶结合不同程度的存在操作复杂，成本较高，重复回收利用率低，会产生二次污染等问题。如中国专利文献cn107117719a公开的《一种去除畜禽养殖废水中抗生素的方法》是将脂肪酶固定在生物炭上用于处理禽养殖废水中四环素类抗生素；cn103289982b公开的《一种新型固定化酶载体的制备》是以大孔吸附树脂为基础载体，利用戊二醛对其表面改性，得到一种新型固定化酶载体。以上固定化技术原材料易得，价格低廉，但是不方便回收重复使用。

而cn106811458a公开的《一种固定化漆酶载体的制备方法和降解微量有机污染物的方法》是通过戊二醛交联被氨基修饰的二氧化硅固定化漆酶用于降解有机污染物；cn105110482b公开的《一种以固定化酶去除工业废水中扑热息痛的方法》是通过氨基化修饰、戊二醛活化的纳米碳球为载体，固定化辣根过氧化物酶去除工业废水中扑热息痛；cn107418950a公开的《多臂磁性复合微球固定化辣根过氧化物酶及其制备方法和应用》是通过六臂聚乙二醇氨基磁性聚合物微球固定β葡萄糖苷酶，戊二醛交联反应修饰，固定化辣根过氧化物酶去除工业废水中苯酚。以上固定化技术具有操作简单和处理效率高优点，但是处理过程使用的戊二醛具有毒性，对生态环境和人体均具有危害。

因此，亟需开发一种用于处理废水中有机物污染物的清洁、高效、低成本、可重复利用及操作简单的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺简便、安全无毒害的固定化木质素过氧化物酶的制备方法，同时提供该固定化木质素过氧化物酶处理废水中的有机污染物的应用

本发明的固定化木质素过氧化物酶的制备方法，是以磁性纳米颗粒为载体，通过多巴胺聚合原位包埋制备磁性二氧化硅固定化木质素过氧化物酶，具体包括以下步骤：

(1)制备四氧化三铁纳米粒子：

按2-5g：0.5-2g：5-10g：100ml的比例，将三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸钠在持续搅拌下依次溶解在乙二醇中，然后转移至高压反应釜中，120-200℃下反应8-16h；冷却后，将固体沉淀用水和乙醇洗涤，最后真空干燥，即得到四氧化三铁纳米粒子；

(2)制备磁性二氧化硅纳米粒子：

按600mg：2-5ml的比例称取步骤(1)制备的四氧化三铁纳米粒子和正硅酸乙酯，将四氧化三铁纳米粒子均匀分散在水、乙醇和氨水的混合体系中，然后再逐滴滴加正硅酸乙酯，在15-35℃下振荡6-12h，用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即得到磁性二氧化硅纳米粒子；

(3)制备多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子：

按600mg：200-500ml的比例将步骤(2)中制备的磁性二氧化硅纳米粒子均匀分散在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，再以1.2-2.0mg/ml的浓度添加盐酸多巴胺，在15-35℃下振荡12-24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤除去未反应的原料，最后真空干燥，即获得多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子，作为固定化木质素过氧化物酶载体；

(4)制备固定化木质素过氧化物酶：

按1g：5-50ml的比例将步骤(3)中获得的固定化木质素过氧化物酶载体(多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子)均匀分散在含有木质素过氧化物酶的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，木质素过氧化物酶蛋白浓度为0.39mg/ml，在15-35℃下振荡6-24h；用磁铁分离产物，所得沉淀用酒石酸-酒石酸钠缓冲液洗涤，直至上清液中无游离酶，最后冷冻干燥，即获得固定化木质素过氧化物酶。

所述步骤(1)中制备的四氧化三铁纳米粒子的粒径为50-200nm。

所述步骤(2)中水、乙醇和氨水的混合体系中水、乙醇和氨水的体积比例为15-20:70-80:1。

所述步骤(4)中酒石酸-酒石酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/l，ph为2.5-3.5。

所述步骤(4)中固定化木质素过氧化物酶的粒径为200-400nm，酶固载量为3-6mg/g，酶活为100-200u/g。

所述步骤(2)、(3)、(4)中的分散方法为机械搅拌或超声波方法。

上述方法制备的固定化木质素过氧化物酶处理废水中的有机污染物，具体过程是：

向含有机污染物的废水中加入固定化木质素过氧化物酶及过氧化氢，室温下反应1-24h，以去除有机污染物。实际操作中可定时取样，分析污染物的浓度变化，直至污染物去除率达到排放标准。

所述固定化木质素过氧化物酶的加入量与废水中有机污染物的质量比为1g:1mg-10mg。

所述过氧化氢在废水中的质量浓度为1.7-6.8mg/l。

上述过程可用于通过固定化木质素过氧化物酶催化降解废水中多环芳烃、酚类、四环素类抗生素等有机污染物。

本发明制备工艺简便，采用的固定化载体是纳米级颗粒，安全无毒害，稳定性好，制备的固定化木质素过氧化物酶具有36.5484m²/g的大比表面积，结合率为56.3-65.6％，在催化体系中的分散性较好，对污染物的去除效率更高，该固定化载体可以通过磁性分离回收重复利用固定化酶。

附图说明

图1是实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶的电镜图。

图2是加酶量对固定化木质素过氧化物酶酶活及固定化酶的结合率的影响示意图。

图3是盐酸多巴胺浓度对固定化木质素过氧化物酶酶活的影响示意图。

图4是固定化时间对固定化木质素过氧化物酶酶活的影响示意图。

图5是温度对游离木质素过氧化物酶和固定化木质素过氧化物酶相对活力的影响示意图。

图6是ph对游离木质素过氧化物酶和固定化木质素过氧化物酶相对活力的影响示意图。

图7是25℃体系中固定化木质素过氧化物酶储存的稳定性示意图。

图8是4℃体系中固定化木质素过氧化物酶储存的稳定性示意图。

图9是固定化木质素过氧化物酶的重复使用稳定性曲线图。

具体实施方式

实施例1

本实施例制备固定化木质素过氧化物酶，具体步骤如下：

(1)四氧化三铁纳米粒子的制备

称取3g三氯化铁、0.8g柠檬酸钠和6g醋酸钠，在持续搅拌下依次溶解在100ml乙二醇中，然后转移至100ml高压反应釜中，200℃下反应10h.冷却后，黑色固体沉淀依次用水和乙醇洗涤数次，真空干燥24h，得到四氧化三铁纳米粒子。

(2)磁性二氧化硅纳米粒子的制备

将600mg制备的四氧化三铁纳米粒子均匀分散在水、乙醇和氨水的混合体系中。混合体系中水、乙醇和氨水的体积分别为40ml、160ml和2ml，然后，逐滴加入3.6ml正硅酸乙酯，在25℃振荡12h，用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤数次除去未反应的原料，真空干燥24h，即得到磁性二氧化硅纳米粒子。

(3)多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子的制备

将600mg磁性二氧化硅纳米粒子，均匀分散在300ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，添加1.6mg/ml的盐酸多巴胺，在25℃振荡12h。用磁铁分离产物，所得沉淀用蒸馏水洗涤数次除去未反应的原料，真空下干燥24h，即获得多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子，即固定化木质素过氧化物酶载体。

(4)固定化木质素过氧化物酶

将1g固定化木质素过氧化物酶载体(多巴胺聚合包埋磁性二氧化硅纳米粒子)均匀分散在30ml含有木质素过氧化物酶的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，木质素过氧化物酶蛋白浓度为0.39mg/ml，在25℃振荡12h。用磁铁分离产物，所得沉淀用酒石酸-酒石酸钠缓冲液洗涤数，直至上清液中无游离酶，冷冻干燥24h，即获得固定化木质素过氧化物酶。酒石酸-酒石酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/l，ph为3，酒石酸的质量浓度为15.1g/l，酒石酸钠的质量浓度为19.4g/l。

图1给出了本实施例制备的固定化木质素过氧化物酶的电镜图。

实施例2

本实施例给出加酶量对固定化木质素过氧化物酶的酶活及固定化酶的结合率的影响。

本实施例与实施例1中的步骤(1)、(2)、(3)一致，

将实施例1中的步骤(4)中“30ml含有木质素过氧化物酶的酒石酸-酒石酸钠缓冲液”分别改为“5ml、10ml、20ml、40ml和50ml”，然后分别测定获得的固定化木质素过氧化物酶的酶活。

图2可以看出加酶量直接影响到固定化酶活。在其它条件相同的条件下，随着加酶量的增加，固定化的酶活逐渐增加。当加酶量超过30ml，固定化酶活增加缓慢。另一方面，随着加酶量的增加，固定化酶的结合率逐渐下降。其加酶量越大，损失量也越大。

综合考虑，选择加酶量为30ml，固定化酶活为180.1u/g，固定化酶的结合率为56.3％。

实施例3

本实施例给出盐酸多巴胺浓度对固定化木质素过氧化物酶的酶活的影响。

本实施例与实施例1中的步骤(1)、(2)、(4)一致，

步骤(3)中分别按照质量浓度为1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml和2.0mg/ml添加盐酸多巴胺，然后分别测定获得的固定化木质素过氧化物酶的酶活。

图3给出了盐酸多巴胺浓度对固定化木质素过氧化物酶的酶活的影响，随着盐酸多巴胺浓度的增加，固定化的酶活逐渐增加。当盐酸多巴胺浓度超过1.6mg/ml，固定化酶活几乎不变。

综合考虑，选择盐酸多巴胺浓度为1.6mg/ml,固定化酶活为182.8u/g。

实施例4

本实施例给出固定时间对固定化木质素过氧化物酶的酶活的影响。

本实施例与实施例1中的步骤(1)、(2)、(3)一致，

将步骤(4)中的振荡时间分别改为1h、3h、6h、8h和24h，然后分别测定获得的固定化木质素过氧化物酶的酶活。

图4给出了固定化时间对固定化木质素过氧化物酶活的影响，随着固定化时间的延长，固定化的酶活逐渐增加。当固定化时间超过12h，固定化酶活力几乎不变。选择固定化时间12h，固定化酶活为188.2u/g。

综合以上述实施例，加酶量为30ml，盐酸多巴胺浓度为1.6mg/ml，固定化时间为12h是制备固定化木质素过氧化物酶的最佳条件。固定化木质素过氧化物酶的酶活平均值为183.4u/g。

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处是：

步骤(1)中称取2g三氯化铁、0.5g柠檬酸钠和10g醋酸钠，在持续搅拌下依次溶解在100ml乙二醇中，然后转移至100ml高压反应釜中，120℃下反应16h。

步骤(2)中加入2ml正硅酸乙酯，在15℃振荡9h。混合体系中水、乙醇和氨水的体积分别为30ml、140ml和2ml。

步骤(3)中是将600mg磁性二氧化硅纳米粒子，均匀分散在200ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，添加1.6mg/ml的盐酸多巴胺，在15℃振荡24h。

步骤(4)中是在35℃下振荡6h。

实施例6

本实施例与实施例1的不同之处是：

步骤(1)中称取5g三氯化铁、2g柠檬酸钠和5g醋酸钠，在持续搅拌下依次溶解在100ml乙二醇中，然后转移至100ml高压反应釜中，160℃下反应8h。

步骤(2)中加入5ml正硅酸乙酯，在35℃振荡6h。混合体系中水、乙醇和氨水的体积分别为35ml、150ml和2ml。

步骤(3)中是将600mg磁性二氧化硅纳米粒子，均匀分散在500ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，添加1.6mg/ml的盐酸多巴胺，在35℃振荡18h。

步骤(4)中是在15℃下振荡24h。

上述各实施例制备的固定化木质素过氧化物酶的粒径为200-400nm，酶固载量为3-6mg/g，酶活为100-200u/g。

实施例7

本实施例对实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶的酶学性能进行测试。

(1)最佳催化温度

在20-80℃的温度范围内，最小单位为10℃，酒石酸-酒石酸钠缓冲液ph为3的环境中，测定每个温度下固定化木质素过氧化物酶的活力。最高酶活为该酶的最适温度，即相对酶活为100％。

由图5可知，游离木质素过氧化物酶相对酶活随温度上升逐渐增强，在30℃达到最大值，此后随着温度的上升，酶活力迅速下降。温度在大于40℃条件下反应时，酶活受到较大程度的抑制，木质素过氧化物酶的相对酶活损失大于50％。到60℃后，酶活力几乎完全丧失。而本发明的固定化木质素过氧化物酶的最适温度为40℃，在20-60℃温度范围内呈现出较高的酶活，保持60％以上的初始活力，这说明固定化有利于提高酶的耐热性。

(2)最佳催化ph

反应体系温度为30℃，ph为2-6的范围内，最小单位为0.5，分别测定不同ph时酒石酸-酒石酸钠缓冲液中木质素过氧化物酶活力，最高酶活为该酶的最适ph值，即相对酶活为100％。

由图6可知，游离木质素过氧化物酶的最适ph为3，ph在2.5-3.5范围内显示较高酶活，ph大于5时酶活受到严重抑制。本发明的固定化木质素过氧化物酶的最适ph为3.5，ph在2.5-4范围内，相对酶活力均保持在70％以上。相对于游离木质素过氧化物酶来说，固定化木质素过氧化物酶稳定的ph范围前后都扩大了，相对酶活也较高。固定化木质素过氧化物酶具有更宽的酸碱耐受范围，这将有利于木质素过氧化物酶更广泛的应用。

(3)储存的稳定性

图7可知，在25℃酒石酸-酒石酸钠缓冲液中储存，游离木质素过氧化物酶的活性下降速度明显比固定化木质素过氧化物酶的快。在缓冲液体系中储存14天后，固定化木质素过氧化物酶能保持约43％的初始活性，而游离木质素过氧化物酶仅保持8.6％的初始活性。

图8可知，在4℃酒石酸-酒石酸钠缓冲液中储存60天后，固定化木质素过氧化物酶保持67.5％的初始活性，而游离木质素过氧化物酶几乎失活。在缓冲液体系中储存30天，固定化木质素过氧化物酶活保持80.3％的初始活性，而游离木质素过氧化物酶活仅38.1％的初始活性，这说明木质素过氧化物酶固定化后其结构更加稳定，更利于长期储存使用。

实施例8

本实施例是对实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶重复使用性测试。

在固定化木质素过氧化物酶的最适温度下进行酶活测定，回收每次催化反应后的固定化酶，用0.1mol/l，ph3.0酒石酸-酒石酸钠缓冲液清洗后，重新加入新催化反应溶液中，测定其酶活性，连续测定8次，考察固定化酶的剩余活性随着使用次数的变化情况。固定化木质素过氧化物酶的重复使用稳定性曲线如图9所示，重复使用4次后，固定化木质素过氧化物酶具有70％的活性，而使用8次后，固定化酶仍具有30％的活力。

实施例9

本实施例是将实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶用于催化降解多环芳烃，具体过程为：

在200ml分别含有浓度为5mg/l的菲(1mg)、5mg/l的荧蒽(1mg)或5mg/l的苯并[a]芘(1mg)的ph＝3.0的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，加入1g实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶(固定化木质素过氧化物酶的加入量与废水中有机污染物的质量比为1g:1mg)，并加入过氧化氢，使体系中的过氧化氢浓度为1.7mg/l，反应体系温度25℃，反应时间为24h。体系中多环芳烃污染物的去除率(％)如表1所示，表1结果表明，在过氧化氢的存在下，固定化木质素过氧化物酶可以有效除去水体中的多环芳烃。

表1固定化木质素过氧化物酶催化降解多环芳烃

实施例10

本实施例是将实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶用于催化降解酚类污染物，具体过程为：

在200ml分别含有浓度为10mg/l的苯酚(2mg)、10mg/l的5-氯苯酚(2mg)或10mg/l的2,4‐二氯酚(2mg)的ph＝3.0的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，加入0.5g实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶(固定化木质素过氧化物酶的加入量与废水中有机污染物的质量比为1g:4mg)，并加入过氧化氢，使体系中的过氧化氢浓度为3.4mg/l，反应体系温度25℃，反应时间为3h。体系中四环素类抗生素的去除率(％)如表2所示，表2结果表明，在过氧化物存在下，固定化木质素过氧化物酶可以快速有效除去水体中的酚类污染物。

表2固定化木质素过氧化物酶催化降解酚类污染物

实施例11

本实施例是将实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶用于催化降解四环素类抗生素污染物，具体过程为：

在200ml分别含有浓度为50mg/l的四环素(10mg)、50mg/l的金霉素(10mg)或50mg/l的土霉素(10mg)的ph＝3.0的酒石酸-酒石酸钠缓冲液中，加入1g实施例1制备的固定化木质素过氧化物酶(固定化木质素过氧化物酶的加入量与废水中有机污染物的质量比为1g:10mg)，并加入过氧化氢，使体系中的过氧化氢浓度为6.8mg/l，反应体系温度25℃，反应时间为1h。体系中四环素类抗生素的去除率(％)如表3所示，表3结果表明，在过氧化物存在下，固定化木质素过氧化物酶可以快速有效除去水体中的四环素类抗生素。

表3固定化木质素过氧化物酶催化降解四环素类抗生素