血管内皮细胞SIRT6基因的应用及药物的制作方法

本发明属于基因功能与应用领域，涉及sirt6内皮特异性敲除小鼠的构建方法及sirt6基因在内皮功能障碍相关疾病中的功能与应用。

背景技术：

血管内皮是许多心血管疾病及其危险因素作用的重要靶器官。血管内皮具有屏障作用；同时，血管内皮作为体内最大的内分泌系统可分泌多种物质维持血管正常结构和功能，其中一氧化氮(nitricoxide，no)是临床评定内皮功能的重要指标。no由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)催化其底物左旋精氨酸生成，具有扩张血管、抑制血小板的聚集与激活、抑制中性粒细胞与单核细胞对血管壁的浸润与吸附、抑制血管平滑肌细胞增殖和抗血栓形成，调节血管张力、维持血管稳态及血管内皮正常功能的心血管保护作用。当在各种内外因素的作用下，血管内皮细胞合成和释放多种血管活性物质和细胞因子之间的平衡被打乱，导致内皮功能障碍(endothelialdysfunction，ed)。其最主要的特征是血管内皮no生物利用度下降和内皮依赖性血管舒张功能受损。

内皮功能障碍是造成动脉粥样硬化的始动环节，也是其发生和发展的基础,同时也是糖尿病血管病变、高血压、急性冠脉综合征等心血管病变的重要病理生理基础。在动脉粥样硬化早期，即内皮功能障碍阶段通过干预措施保护内皮功能无疑可减少动脉粥样硬化的发病率并降低其致残致死率，具有重要的临床意义。目前认为内皮功能障碍可以部分逆转，因此，阐明其机制并找到安全有效的干预措施是防治心血管疾病的关键环节。

sirt1-sirt7为第iii类组蛋白去乙酰化酶(sirtuins)家族的7个同源蛋白，在细胞中的定位和功能各不相同。大量证据表明，组蛋白去乙酰化酶sirtuins(sirt1-sirt7)家族通过去乙酰化修饰参与心血管、肿瘤和代谢性等疾病的调控。随着研究深入，人们发现定位在细胞核中的sirt6通过去乙酰化修饰组蛋白参与调控血管内皮细胞的炎症和自噬等过程，影响内皮功能障碍，进而参与心血管疾病的发生发展过程。最新报道表明，sirt6可通过修复dna损伤保护血管内皮功能，并参与调控内皮细胞的炎症反应。然而sirt6在内皮功能障碍中发挥保护作用的机制尚未有任何相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供血管内皮细胞sirt6基因的应用及基于其的抗心血管疾病的药物。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了血管内皮细胞sirt6基因在制备治疗内皮功能障碍所致的心血管疾病的药物中的应用。

优选地，所述的药物为调节血管内皮no释放水平及nos酶活性的药物。

优选地，所述的药物为调节血管内皮依赖性舒张功能的药物。

优选地，所述的药物为调节主动脉血管中enos蛋白表达的药物。

优选地，所述的药物为保证血管渗透性的药物。

本发明还公开了一种小分子激动剂，所述小分子激动剂为特异性激活sirt6基因的激动剂。

本发明还公开了上述小分子激动剂在制备治疗内皮功能障碍所致的心血管疾病的药物中的应用。

本发明还公开了一种用于治疗心血管疾病的药物，该药物以sirt6基因为靶点，增强sirt6基因表达水平。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以内皮细胞特异性sirt6基因敲除小鼠为实验对象，通过与对照组sirt6^flox/flox小鼠相比较，发现内皮细胞特异性sirt6基因敲除小鼠的血管内皮no释放水平及nos酶活性显著下降，血管舒张功能、屏障功能受损，提示内皮细胞中sirt6的缺失会导致严重的内皮功能障碍，进而可能引发其他心血管病变。通过本发明说明sirt6基因具有保护内皮功能的作用，为sirt6在研究防治心血管疾病的新靶点和新策略中所发挥的作用提供了理论依据和临床基础。

因此，本发明奖sirt6基因作为药物靶点，构建sirt6基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗内皮功能障碍的药物；sirt6基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗内皮功能障碍的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗内皮功能障碍的目的。以sirt6为靶点设计小分子化合物激动剂，利用体外细胞模型或动物模型，通过筛选发现其中能特异性激活sirt6的分子，从而为心血管疾病中内皮功能障碍的治疗提供新的治疗性分子。

附图说明

图1为内皮细胞sirt6特异性敲除小鼠的构建及鉴定结果图；其中，(a)为sirt6内皮特异性敲除小鼠构建的原理图；(b)为小鼠pcr鉴定的结果图；(c)为western验证小鼠主动脉中sirt6蛋白表达的表达情况；

图2为内皮细胞sirt6特异性敲除小鼠的表型及组织形态学分析；

图3为内皮细胞中sirt6的缺失对小鼠血清中no含量及nos酶活性的影响结果图；其中，(a)为no含量；(b)为nos酶活性；

图4为内皮细胞中sirt6的缺失对小鼠主动脉血管中enos蛋白表达影响；

图5为内皮细胞中sirt6的缺失对小鼠血管内皮依赖的舒张功能的影响结果图；其中，(a)为不同浓度ach(内皮依赖性血管舒张剂)对小鼠胸主动脉张力的影响；(b)不同浓度snp(非内皮依赖性血管舒张剂)对小鼠胸主动脉张力的影响；

图6为内皮细胞中sirt6的缺失对小鼠血管屏障功能的影响结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

注：本发明的实验动物及饲养条件如下：内皮细胞特异性cre转基因小鼠(tie2-cre)购买于南京大学模式动物研究所(货号：008863)；sirt6^flox/flox小鼠购买于美国jacksonlaboratory(货号：017334)。小鼠词养于西安交通大学医学实验动物中心spf(specialpathogenfree,spf)级屏障环境中(许可证号：scxk(陕)2012-003)，维持温度22℃左右，相对湿度70％左右，明暗环境自动转换时间为12h。动物自由进食和饮水，实验严格按照西安交通大学动物中心实验动物管理规定进行动物饲养和取材，所有实验动物均得到本院校伦理学委员会审核、批准。

本发明所述的sirt6基因，已报到的，人类的sirt6基因位于染色体19p13.3区域，包括8个外显子，全长355个氨基酸，分子量为39.1kd，等电点为9.12(mahlknecht等.2006)。

实施例1sirt6内皮特异性敲除小鼠的构建及鉴定

为了进一步研究内皮细胞中sirt6的缺失对血管内皮的功能，本发明构建了sirt6内皮特异性敲除小鼠。首先，将雌性的sirt6^flox/flox小鼠与雄性的c57bl/6jtie2-cre小鼠杂交，获得tie2-cre/sirt6^flox/+小鼠；然后再将雄性tie2-cre/sirt6^flox/+小鼠与雌性的sirt6^flox/flox小鼠杂交，最终获得纯合型的sirt6内皮特异性敲除小鼠，即ecsirt6^-/-小鼠。本发明选择sirt6^flox/flox小鼠用作野生型对照组小鼠。

sirt6内皮特异性敲除小鼠的鉴定：首先使用美国biotool公司的试剂盒提取待鉴定小鼠的dna，pcr扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。剪取欲鉴定小鼠的尾巴约3mm，放入1.5mlep管中。按小鼠数量配制组织消化液，充分混匀后使用。向每个含有样本的ep管中加入100μl新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化30min。将样本置于95℃水浴中孵育5min以灭活消化液中的蛋白酶。12000rpm离心5分钟，取上清作为pcr模板。消化后的上清可于-20℃保存三个月。上下游引物序列如下表1所示，最后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定所需基因型的小鼠。

表1

为了确认sirt6内皮特异性敲除小鼠是否构建成功，本发明提取了小鼠胸主动脉血管组织蛋白，通过蛋白质印迹法(westernblotting)鉴定各组小鼠主动脉中sirt6蛋白的表达量，结果参见图1，结果表明，与对照组相比，sirt6内皮特异性敲除小鼠的胸主动脉中sirt6表达显著降低，证明构建成功。

实施例2sirt6内皮特异性敲除小鼠及sirt6内皮特异性敲除高脂血症小鼠组织形态学的观察

1、取材：实验结束后，处死各组小鼠，用眼科剪轻柔地摘取胸主动脉、劲动脉、心脏、肝脏等组织。用生理盐水洗去黏附的血液，轻轻吸干。先在4％的多聚甲醛中固定48h，然后再用15％的蔗糖溶液脱水24h，最后用30％的蔗糖溶液脱水24h。脱水完成后，用otc进行组织包埋。用冰冻切片机将包埋好的组织切成7μm厚度均匀的切片，于-80℃冰箱中冰冻保存并进行下一步he染色。

2、染色：从-80℃中取出切片，复温30min；用4％的多聚甲醛固定15min；用pbs冲洗1min，冲洗2次；苏木素染色10min；用去离子水冲洗，并于显微镜下观察染色情况；1％的盐酸酒精分化10s，流水冲洗15min；伊红染色2min，流水冲洗3次；90％酒精脱水处理1min，重复2次；95％酒精脱水处理1min，重复2次；100％酒精脱水处理1min，重复2次；二甲苯透明处理3min，重复3次；用中性树胶进行封闭处理，晾干后显微镜下观察。结果如图2所示，正常饮食小鼠各组织he染色结果表明，与对照组ecsirt6^+/+小鼠相比，ecsirt6^-/-小鼠颈动脉、主动脉等血管结构无明显的病理学改变。

实施例3sirt6内皮特异性敲除小鼠血清no含量及nos酶活性检测

小鼠眼眶取血约1.5ml，3500rpm离心10min，收集上清液，置于-20℃保存。采用一氧化氮测定试剂盒，用硝酸还原酶特异性地将no^3-还原为no^2-，再通过其显色深浅，反映no浓度的高低。采用nos酶活性试剂盒，分别检测tnos、inos及cnos的酶活性。结果如下表2和图3所示：

表2

从图3中可以看出，sirt6在内皮细胞中的缺失会降低小鼠血清中no的含量及总nos，cnos的酶活力，且纯合型的sirt6内皮特异性敲除小鼠血清中的no含量，总nos、cnos酶活力比杂合型的sirt6内皮特异性敲除小鼠降低的更为显著。

实施例4小鼠胸主动脉环舒张活性测定

将小鼠处死后，分离胸主动脉，置于预冷的kreb’s液中，制成长2mm的血管环标本。血管环标本用细钢丝固定于浴槽中，并连接于dmt血管张力测量系统，浴槽中事先充入6mlkreb’s缓冲液，记录血管张力的变化。血管环标本平衡于37℃用95％氧气，5％二氧化碳混合气体饱和的kreb’s缓冲液中，调零至血管张力不再有较大变化。调零后，给予3mn预张力，30min内调节预张力至稳定。之后，让血管环标本在37℃混合气体饱和的kreb’s液中平衡90min(其间每隔20min换一次kreb’s液)。

平衡时间结束后，将浴槽中的kreb’s液定容到5ml，用高钾kreb’s液(k⁺-kreb’s)刺激血管收缩，达到收缩平台后，用kreb’s液冲洗3次，使回到基线水平，重复高钾kreb’s液测试。向浴槽中依次加入ne梯度溶液，每次加药量50μl，使浴槽中ne终浓度依次达到1×10^-9，3×10^-9，1×10^-8，3×10^-8，1×10^-7，3×10^-7，1×10^-6，3×10^-6，1×10^-5mol/l。记录血管张力变化，最后一个浓度达到收缩平台后，依次加入ach或snp梯度溶液，使浴槽中ach或snp的终浓度依次达到1×10^-9，3×10^-9，1×10^-8，3×10^-8，1×10^-7，3×10^-7，1×10^-6，3×10^-6，1×10^-5mol/l。去除状态较差的血管样本，计算各浓度引起收缩/舒张值相对于60mmolk⁺所引起的收缩值的百分比，求平均数和标准差。结果参见图5，实验结果表明，内皮细胞中sirt6的缺失导致小鼠血管内皮依赖性舒张功能障碍。

实施例5小鼠肺血管渗透性测定

采用evansblue法检测小鼠肺血管内皮通透性，基本步骤如下：

(1)尾静脉注射1％的伊文思蓝(evansblue)，剂量为25mg/kg体重；

(2)2h后处死，于右心室注入6～10mlpbs灌流肺血管，至整个肺变白；

(3)取右肺下叶，用滤纸拭去肺组织表面水分，称肺湿重；

(4)加入甲酰胺，剂量为1ml/mg肺湿重；

(5)置于60℃温箱24h，使其充分反应；

(6)以12000g离心30min，取上清液；

(7)配制伊文思蓝标准品：将伊文思蓝溶于甲酰胺中，配制成浓度为10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml的伊文思蓝标准品；

(8)于96孔板中相应各孔中加入不同浓度的伊文思蓝标准品和样本，空白孔中加入甲酰胺200μl，于分光光度计上测定od620值；

(9)以伊文思蓝标准品浓度作横坐标，(伊文思蓝标准品od620-空白孔od620)值作纵坐标，绘制标准曲线；

(10)根据标准曲线，计算样本肺组织中伊文思蓝浓度。

从肺组织提取伊文思蓝染料进行比色结果参见图6，结果表明，ecsirt6^-/-组小鼠肺组织中伊文思蓝含量显著高于ecsirt6^+/+组。证明sirt6在内皮细胞中的缺失会导致小鼠血管通透性增加。

综上所述，本发明以tie-cre转基因小鼠和flox转基因小鼠为基础，利用cre-loxp条件性基因敲除技术，将sirt6^flox/flox小鼠与c57bl/6jtie2-cre这2种小鼠杂交后获得血管内皮细胞sirt6基因特异性敲除小鼠，并进一步验证内皮细胞中sirt6的表达是否明显缺失。结果表明，sirt6内皮特异性敲除小鼠血清中的no含量及总nos酶活性显著降低；主动脉中enos蛋白表达下调；血管内皮依赖性的舒张功能障碍；血管内皮的渗透性增加，屏障功能受损。证明内皮细胞中sirt6基因的特异性缺失会导致小鼠发生严重的内皮功能障碍。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。