一种蔗糖水解酶突变体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种蔗糖水解酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术：

蔗糖水解酶(sh,ec3.2.1.–)，属于gh13糖苷水解酶家族，是一个很强的水解酶。几乎没有转苷能力，可将蔗糖分子几乎等比例地水解为葡萄糖和果糖分子。蔗糖水解酶含有5个结构域(a、b、b'、c和n)，其中a、b和b'-结构域构成了蔗糖水解酶的催化核心。

现有的蔗糖水解酶大多水解能力很强，转苷能力相对比较弱。研究水解和转苷的决定机制一直是一个热门的话题。目前，已经有许多关于水解和转苷的报道，但大多集中在供体和受体位点，能够显著改变水解和转苷平衡的的方法目前报道的还很少。因此，本发明通过单点突变即显著提高了蔗糖水解酶的转苷能力，说明此位点对蔗糖水解酶的水解和转苷作用很重要。进而该位点可以为其他糖苷水解酶的水解和转苷的改造提供参考和借鉴。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种蔗糖水解酶的突变体，对caulobactercrescentusna1000cb15来源的蔗糖水解酶的第271位丝氨酸进行突变；

或，对janthinobacteriumagaricidamnosumnbrc102515来源的蔗糖水解酶的第279位丝氨酸进行突变；

或，对xanthomonasaxonopodispv.glycines来源的蔗糖水解酶的第281位丝氨酸进行突变；

上述突变位点与蔗糖水解酶的转苷作用和水解作用相关。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于caulobactercrescentusna1000cb15蔗糖水解酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述来源于janthinobacteriumagaricidamnosumnbrc102515蔗糖水解酶的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述来源于xanthomonasaxonopodispv.glycines蔗糖水解酶的氨基酸序列如seqidno.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变是将氨基酸序列如seqidno.1所示的第271位丝氨酸残基变为丙氨酸残基，突变体命名为s271a；

或，所述突变是将氨基酸序列如seqidno.2所示的第279的丝氨酸残基变为丙氨酸残基，突变体命名为s279a；

或，所述突变是将氨基酸序列如seqidno.3所示的第281的丝氨酸残基变为丙氨酸残基，突变体命名为s281a。

编码所述蔗糖水解酶突变体的基因。

携带所述蔗糖水解酶突变体的基因的载体。

携带所述蔗糖水解酶突变体的基因的重组细胞。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种蔗糖水解酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)在蔗糖水解酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带蔗糖水解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并分别纯化蔗糖水解酶突变体s271a、s281a、s279a。

所述质粒载体为puc系列，pet系列，或pgex中的任意一种。

所述宿主细胞为细菌和真菌细胞，其也为本发明的保护范围。

所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

所述的蔗糖水解酶突变体在生产多聚糖中的应用。

有益效果：

本发明对来源于caulobactercrescentusna1000cb15的蔗糖水解酶第271位的丝氨酸残基进行定点突变，来源于janthinobacteriumagaricidamnosumnbrc102515的蔗糖水解酶第279位的丝氨酸残基进行定点突变，来源于xanthomonasaxonopodispv.glycines的蔗糖水解酶第281位的丝氨酸残基进行定点突变，获得的单突变体酶的转苷活性较野生型蔗糖水解酶均得到提高。在最优的酶转化条件下，蔗糖水解酶突变体转苷活性较野生酶水解活性最大提高10倍。因此，本发明提供的蔗糖水解酶突变体s271a、s279a、s281a可以应用于糖苷水解酶工业生产多聚糖。

附图说明

图1野生酶以及突变体的水解率、异构率、聚合率和转苷率的hplc检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的培养基和计算方法如下：

lb固体培养基：5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，5g/lnacl，2％琼脂粉。

lb液体培养基：5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，5g/lnacl。

水解率＝{(生成的葡萄糖含量)/(消耗的蔗糖含量-生成的果糖含量)}*100％

异构率＝{(异构产物含量)/(消耗的蔗糖含量-生成的果糖含量)}*100％

聚合率＝{(聚合产物含量)/(消耗的蔗糖含量-生成的果糖含量)}*100％

转苷率＝异构率+聚合率

具体实施方式

实施例1：重组菌构建

根据ncbi上登录号为yp_002516566.2的蔗糖水解酶基因序列采用化学合成法合成含有蔗糖水解酶的ccsh基因，登录号为cdg80999.1的蔗糖水解酶基因序列采用化学合成法合成含有蔗糖水解酶的jash基因，登录号为aaq93678.1的蔗糖水解酶基因序列采用化学合成法合成含有蔗糖水解酶的xash基因。将ccsh基因、jash基因和xash基因分别与pet-24a(+)质粒用ndei和hindⅲ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用t4连接酶连接，连接产物转化e.colijm109感受态细胞，得到重组细胞。将重组细胞经37℃培养8h，挑取转化子在lb液体培养基(含30mg/l卡纳霉素)中震荡培养，提取质粒，酶切验证后分别得到表达质粒ccsh/pet-24a(+)、jash/pet-24a(+)、xash/pet-24a(+)。

将质粒ccsh/pet-24a(+)、jash/pet-24a(+)、xash/pet-24a(+)分别转化e.colibl21(de3)宿主菌，涂布lb平板(含30mg/l卡纳霉素)，37℃培养8h，挑单菌落到lb液体培养基(含30mg/l卡纳霉素)中，37℃培养过夜，保存于甘油管中。

挑取重组菌e.colijbl21(de3)/ccsh/pet-24a(+)、e.colibl21(de3)/jash/pet-24a(+)、e.colijbl21(de3)/xash/pet-24a(+)，于lb液体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到tb培养基(含30μg/ml卡纳霉素)中，当600nm处的光密度达到0.6时，加入0.4mm异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，在25℃摇床中培养24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心20min除菌体，收集离心上清液得到粗酶液。

实施例2：蔗糖水解酶突变体的制备

(1)蔗糖水解酶单突变的制备

根据蔗糖水解酶的ccsh基因序列，设计并合成引入s271a突变的引物，利用快速pcr技术，以携带编码野生型蔗糖水解酶的基因的质粒ccsh/pet-24a(+)为模板，对蔗糖水解酶的ccsh基因序列进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第271位ser密码子变成ala密码子的基因，得到蔗糖水解酶单突变s271a。

根据蔗糖水解酶的jash基因序列，设计并合成引入s279a突变的引物，利用快速pcr技术，以携带编码野生型蔗糖水解酶的基因的质粒jash/pet-24a(+)为模板，对蔗糖水解酶的jash基因序列进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第279位ser密码子变成ala密码子的基因，得到蔗糖水解酶单突变s279a。

根据蔗糖水解酶的xash基因序列，设计并合成引入s281a突变的引物，利用快速pcr技术，以携带编码野生型蔗糖水解酶的基因的质粒xash/pet-24a(+)为模板，对蔗糖水解酶的xash基因序列进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第281位ser密码子变成ala密码子的基因，得到蔗糖水解酶单突变s281a。

引入s271a突变的定点突变引物为：

核苷酸序列为seqidno.4的正向引物：

5’-ggctttcgcttagatgccgcaccgtttctgtgg-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列为seqidno.5的反向引物：

5’-ccacagaaacggtgcggcatctaagcgaaagcc-3’(下划线为突变碱基)

引入s279a突变的定点突变引物为：

核苷酸序列为seqidno.6的正向引物：

5’-gtgtttcgcttagatgcaaccgcctttctg-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列为seqidno.7的反向引物：

5’-cagaaaggcggttgcatctaagcgaaacac-3’(下划线为突变碱基)

引入s281a突变的定点突变引物为：

核苷酸序列为seqidno.8的正向引物：

5’-ggcatttcgtctggatgcaacagcgtatctgtg-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列为seqidno.9的反向引物：

5’-cacagatacgctgttgcatccagacgaaatgcc-3’(下划线为突变碱基)

pcr反应体系均为：5×psbuffer10μl，dntpsmix(2.5mm)4μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna1μl，primerstarhs(5u/μl)0.5μl，加入双蒸水至50μl。

pcr扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。

pcr产物经dpnⅰ消化，转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)培养过夜后，挑克隆于lb液体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为e.colijm109/ccsh/pet-24a(+)(s271a)、e.colijm109/jash/pet-24a(+)(s279a)、e.colijm109/xash/pet-24a(+)(s281a)。

测序正确的突变体，从甘油管接种至lb培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到的重组菌命名为e.colijbl21(de3)/ccsh/pet-24a(+)(s271a)、e.colibl21(de3)/jash/pet-24a(+)(s279a)、e.colijbl21(de3)/xash/pet-24a(+)(s281a)。

(2)突变体酶的发酵与纯化

分别挑取重组菌e.colijbl21(de3)/ccsh/pet-24a(+)(s271a)、e.colibl21(de3)/jash/pet-24a(+)(s279a)、e.colijbl21(de3)/xash/pet-24a(+)(s281a)，于lb液体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到tb培养基(含30μg/ml卡纳霉素)中，当600nm处的光密度达到0.6时，加入0.4mm异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，在25℃摇床中培养24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心20min除菌体，收集离心上清液得到粗酶液。

实施例3：粗酶液的浓缩

将实施例1和2中获得的酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数20％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8～10小时沉淀蛋白。混合物经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的50mmkh2po4-na2hpo4缓冲液(ph7.0)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清透析后获得浓缩酶液。

实施例4：hplc检测水解和转苷产物的产量

在反应器中加入100mm蔗糖作为底物，加入6u/ml酶活的实例3中获得的突变体的浓缩酶液，和野生型加酶量保持一致。在30℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时后取样，终止反应后，过膜过滤并进行hplc分析。

色谱条件如下：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，agilent氨基柱5mm,(4.6mm×250mm)示差折光检测器；流动相为080％乙腈，20％超纯水，流速0.8mlmin^-1；柱温35℃。

hplc检测结果见图1，其中水解率表示生成的葡萄糖含量，异构率表示生产的异构产物(异构产物是松二糖和海藻酮糖)的含量，聚合率表示生产的聚合产物(聚合产物是麦芽寡糖)的含量，转苷率包括异构率加聚合率。

结果数值见表1，蔗糖水解酶的突变体转苷率大幅度增加，其中突变体s281a的转苷率增加幅度最大。是野生型的转苷率的11倍左右，水解率降低至野生型的34％左右；突变体s279a的转苷率是野生型的转苷率的10倍左右，水解率降低至野生型的59％左右；突变体s271a的转苷率是野生型的转苷率的8倍左右，水解率降低至野生型的49％左右。这说明突变位点是蔗糖水解酶糖苷和水解功能的关键位点，对于糖苷水解酶的糖苷和水解性质的研究具有重要意义。

表1野生酶以及突变体的水解率、异构率、聚合率和转苷率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

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<213>人工合成

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