本发明属于节瓜技术领域，具体涉及一种节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1及其应用。
背景技术：
瓜类枯萎病(fusarumoxysporusschl.f.sp.cucumerirumowen.)又称蔓割病、萎凋病，是一种世界性土传病害，一般由尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)引起，主要危害黄瓜、冬瓜、节瓜等其它葫芦科属作物。
节瓜(benincasahispidacogn.var.chieh-quahow)是葫芦科冬瓜属的重要蔬菜作物，也是我国岭南地区的名优瓜类蔬菜，深受消费者喜爱。近年来，节瓜枯萎病发病趋势日益加剧，严重阻碍了节瓜的生产。由于节瓜遗传背景狭窄，抗枯萎病资源较少，尚未分离出优异的枯萎病抗性基因，且抗性分子机理研究缺乏。
wrky类转录因子是广泛存在于植物界中的一类重要转录调控因子，其n-端含有wrkygqk高度保守氨基酸序列，通过调节启动子中含w-box元件的基因的表达，参与植物对病原体的防卫反应、非生物胁迫、生长发育等过程，特别是在植物抗病反应中起到重要的作用。然而，目前关于wrky类转录因子在节瓜枯萎病抗性方面的研究尚未见报道。因此，开展节瓜wrky类转录因子在节瓜枯萎病抗性方面的研究，不仅可以在遗传水平方面揭示wrky参与节瓜枯萎病抗性的作用，也为节瓜枯萎病抗性分子辅助育种提供理论支撑，具有重要研究价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1及其编码蛋白。
本发明的目的还在于提供上述节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1的应用。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1，其核苷酸序列如seqidno：1所示。
上述节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1的编码蛋白，其氨基酸序列如seqidno：2所示。
本发明所述节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1是将节瓜幼苗真叶的总rna反转录成cdna，以cdna为模板，用如seqidno：3和seqidno：4所示的引物对进行pcr扩增获得。
其中引物对具体为：
cqwrky1-f：atggcctcctcttccgggag
cqwrky1-r：ctaacataggagagattgga
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1在调控节瓜镰刀菌酸抗性方面的应用。
本发明将cqwrky1基因克隆到pearleygate101载体上，获得pearleygate101-cqwrky1植物过表达载体。
结果发现，在镰刀菌酸(fusaricacid，fa，枯萎病病菌分泌物，市售)胁迫下，转基因植株的抗性明显弱于对照，说明节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1在调控节瓜枯萎病抗性方面有一定的负向作用。因此，在后续的生产实践中，可以通过敲除节瓜中的wrky类转录因子基因cqwrky1，从而提高节瓜的抗枯萎病性能。
本发明具有如下优点：本发明利用电子克隆技术分离鉴定了节瓜cqwrky1的编码序列信息；利用特异引物研究了cqwrky1在不同逆境胁迫下的表达，发现节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1可以被多种胁迫因素诱导表达；构建的节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1过表达植株的镰刀菌酸抗性降低，说明该基因负调控节瓜的枯萎病抗性，因而可以进一步在后续的生产实践中，可以通过敲除节瓜中的wrky类转录因子基因cqwrky1，从而提高节瓜的抗枯萎病性能。
附图说明
图1是实施例1中节瓜cqwrky1基因的克隆，其中1-3是cqwrky1基因的cds扩增结果，m是dnamarker条带；
图2是实施例2中节瓜cqwrky1基因在不同逆境胁迫下的表达；
图3是实施例3中节瓜cqwrky1过表达阳性植株的检测；
图4是实施例4中cqwrky1过表达植株的镰刀菌酸抗性降低，其中a图代表镰刀菌酸处理前植株的生长状况，b图为镰刀菌酸处理后植株的生长情况，oe5、6、13分别代表过表达(overexpressing:oe)cqwrky1基因的阳性纯合株系。
具体实施方式
下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1及其编码蛋白的获取
(1)rna提取和cdna的克隆
选用的节瓜品种为新农民节瓜品种的自然授粉后代经过系谱法选育而来的纯合自交系材料。
温汤浸种种子6-8小时，然后在30-32℃的培养箱中催芽2-3天，待种子露白时播种。幼苗长到一叶一心后，对3株幼苗的真叶进行混合取样，加入液氮后用研钵裂解组织和细胞，并迅速转入2.0ml的离心管中，采用植物总rna提取试剂盒(rnapreppuretissuekit，tiangen)；用分光光度计检测rna的浓度，同时琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。接下来，使用大连宝生物公司的逆转录试剂盒(primescriptreversetranscriptasekit，takara)，反转录成cdna。
(2)cqwrky1基因的扩增
以节瓜总cdna为模板，以cqwrky1-f(atggcctcctcttccgggag，如seqidno：3所示)和cqwrky1-r(ctaacataggagagattgga，如seqidno：4所示)为正向和反向引物，克隆获得节瓜cqwrky1基因片段。
pcr反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃复性2分钟，72℃延伸45秒，34个循环后72℃8分钟。最终pcr产物进行测序，获得了cqwrky1的序列，如图1所示，其中1-3是cqwrky1基因的cds扩增结果，m是dnamarker条带。
通过ncbi-blast和mega6.0软件比对发现，该序列与西瓜wrky1-like(hm030879.1)、黄瓜wrky33-like(nm_001280728.1)等同源性较高，且含有polya结构，表明cqwrky1是一个编码wrky类转录因子的基因。
该节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1的核苷酸序列具体如下：
atggcctcctcttccgggagcgtagacacctctgctaattctcatccttctttcactttctctactcatccttttatgacttcttactctgaccttctcgcttcctccaacaacgatcctccttcctccgccgcaccccacgcttctctccgcggttccggtactggggttcctaaattcaaatccctccctcctccttctctccctctctctcctcctcccatgtctccttcttcctttttcgctattcctcctggcttgagtcccgctgagcttcttgattcccctgttcttctcagtgcttctcatgttctgccgtcgccgactaccgggagtttcccgtctcagtcgttgaattggaagagcaattctgggtgtaatcagcagagcattaaggaagaaaacaaatatttgtccaatttctcatttcaaactcaatcgtcaaagtttccgccgacgtcttttcagccttcatccaccacagctcctacgactcagggatggagttttcaagaacagcggaagaaagaggacggtttctcgtcggagaagaatatggtgaagccggagttcggatcgatgcggagcttctcaccggaatatggggttgttcaaaaccagagccaaaacaacggcagcggggagttgcagtctgactacggcaataattaccctcaacaatctcagacgttgaatcgaaggtcggacgacggctacaactggagaaaatacggccaaaaacaggttaaaggaagtgaaaatccgagaagctattataagtgcactttccccaattgcccaactaagaaaaaggttgaaagatccttagatggacagatcacggagattgtttacaaaggcagccataaccatgccaagccccaatccacgaggaggtcgtcactgtcgtcagccggttcttcccacgccctggtggctttgattccggctactaatgagatggcggaccaatcatttacaacccaaggcagcggccaattcgacggcgttgcaacgccggagaattcctcaatttcaatcggcgacgacgacttcgatcgaagctctcaaaagagcaaatccggaggggacgattttgatgaggacgaaccagaggctaagagatggcgaagggaaggtgacaacaatgaaggtatttcggcggtcggtagccggacggtgagagagccgagagtcgtcgtccaaaccaccagcgacatcgacattctggacgatggttaccggtggaggaagtacggccagaaagttgtgaagggaaacccaaatccaaggagttactacaaatgcacaaatccaggatgtccagtaagaaagcacgtggagagagcttcacatgatctaagagcagtgatcacaacttatgaagggaagcacaaccatgatgttccaccagcacgtggcagtggaagccattccctcagccgtccattccccagcaacgaccctccggccacggcgatccgcccatcggcagtgacccatcagtcaaacaacggggggcatttgcaaggtctaaggctgcagcaatcttcagagtcccaaacagcattcacagtggaaatggtgcaaaatgggaatggattttcattcccagaatttggaaactcaatgggaatgggagtaggatcctacatcaaccaaacacagcctaatgacaatttgttaatcagagctaaagaagagccaagagatcatgacatgttcatccaatctctcctatgttag。
该节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1的编码蛋白的氨基酸序列具体如下：
masssgsvdtsanshpsftfsthpfmtsysdllassnndppssaaphaslrgsgtgvpkfkslpppslplspppmspssffaippglspaelldspvllsashvlpspttgsfpsqslnwksnsgcnqqsikeenkylsnfsfqtqsskfpptsfqpssttapttqgwsfqeqrkkedgfsseknmvkpefgsmrsfspeygvvqnqsqnngsgelqsdygnnypqqsqtlnrrsddgynwrkygqkqvkgsenprsyykctfpncptkkkversldgqiteivykgshnhakpqstrrsslssagsshalvalipatnemadqsfttqgsgqfdgvatpenssisigdddfdrssqksksggddfdedepeakrwrregdnnegisavgsrtvreprvvvqttsdidilddgyrwrkygqkvvkgnpnprsyykctnpgcpvrkhverashdlravittyegkhnhdvppargsgshslsrpfpsndppatairpsavthqsnngghlqglrlqqssesqtaftvemvqngngfsfpefgnsmgmgvgsyinqtqpndnllirakeeprdhdmfiqsllc-。
实施例2cqwrky1在不同逆境胁迫下的表达研究
根据cqwrky1的cdna序列，设计实时定量pcr(qrt-pcr)引物：cqwrky1-q-f:cctcctccttctctccctct；cqwrky1-q-r:aacgactgagacgggaaact。所用的内参引物为节瓜的actin引物，actin-q-f：tcaacccaaaggctaacag；actin-q-r:cttgtccatcaggcagttc。
将cdna模板稀释5倍，配制20μl的反应体系：10μlsybrpremixextaqii(2×)，0.8μlforwardprimer，0.8μlreverseprimer，2μlcdna，0.4μlroxreferencedyeii，6.0μlddh2o，然后在荧光定量pcr仪(abiprism7500ht，appliedbiosystems)上进行扩增反应。
反应程序为：95℃，30sec，95℃，5sec，60℃，34sec，总共40个循环。然后在荧光定量pcr仪(abiprism7500ht，appliedbiosystems)上进行扩增反应，以ubiqutin基因作内参，计算基因的相对表达量。
每个样品设置3个生物学重复，每个生物学重复包括3个技术重复定量。分别在正常条件下，aba，6-ba，ga，iaa，高温，低温以及镰刀菌酸(fa)条件下检测cqwrky1的表达量变化。
结果如图2所示，从图2中可以得出cqwrky1最易受fa胁迫诱导表达。
实施例3cqwrky1过表达载体的构建与阳性植株的检测
(1)cqwrky1过表达载体的构建
以cqwrky1基因的cdna为模板，pcr扩增1746bp的编码区，pcr扩增产物回收纯化，采用gateway技术将cqwrky1基因连接到过表达载体pearleygate101质粒上，转化后挑选阳性克隆进行测序，正确的质粒转化农杆菌gv3101，以50mg/l的rif和50mg/l的kan作为抗性筛选，获得的单克隆经过pcr鉴定为阳性。通过农秆菌介导法，转化节瓜材料。
(2)过表达植株检测
根据过表达载体序列(pearleygate101载体是由广东省农业科学院蔬菜研究所提供，用于(1)中制备过表达载体)和cqwrky1的编码区(cds)序列设计的特异性引物cqwrky1-f:atggcctcctcttccgggag；cqwrky1-r:ctaacataggagagattgga))。以转化空白载体为对照，pcr扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，能够扩增出目标条带的为阳性植株；另一方面，以转基因受体亲本的cqwrky1基因的表达量为对照，cqwrky1基因表达水平显著上升的植株为阳性植株，分别为过表达(overexpressing:oe)cqwrky1基因的阳性纯合株系oe5、oe6和oe13(图3)。
实施例4过表达植株的镰刀菌酸胁迫抗性鉴定
将过表达cqwrky1基因的t2纯系节瓜种子(t0代阳性植株经过自交授粉得到t1代植株，然后t1代经过自交授粉得到t2代植株，经过qpcr检测获得纯系过表达种子)和对照种子在相同条件下进行催芽，之后播种在灭菌的基质中。待长到一叶一心时，将幼苗移出基质并把根部土壤清洗干净，用刀片划伤根部后将其放入培养瓶中，加入浓度为200mg/l的镰刀菌酸溶液(fusaricacid，fa，枯萎病病菌分泌物，市售)，使幼苗根部完全浸没在镰刀菌酸溶液中。随时观察植株的生长情况，直至表型在对照和转基因植株间出现差异。每个培养瓶中放6株，每次平行做3个重复。
从图4中可以看出，在fa胁迫下，转基因植株的抗性明显弱于对照，说明cqwrky1在调控节瓜枯萎病抗性方面有一定的负向作用。但是在生产上可以通过基因编辑技术，敲除cqwrky1基因，或通过rna干扰技术，降低cqwrky1基因的表达量，从而达到提高节瓜枯萎病抗性的效果。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>广东省农业科学院蔬菜研究所
<120>一种节瓜wrky类转录因子基因cqwrky1及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1746
<212>dna
<213>节瓜(benincasahispidacogn.var.chieh-quahow)
<400>1
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<210>2
<211>581
<212>prt
<213>节瓜(benincasahispidacogn.var.chieh-quahow)
<400>2
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