一种与复发性流产相关的微生物及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种与复发性流产相关的微生物及其应用。

背景技术：

复发性流产(habitualabortion)指连续发生自然流产2次或2次以上。大多数复发性流产出现在妊娠早期，并且大多数复发性流产病人妊娠终止于相同妊娠天数，复发性流产病人流产时的临床表现及过程与常见病人的自然流产一致。早期妊娠流产发生原因复杂，常为子宫发育异常、内分泌原因、周围环境物理、化学因素等，但找不到具体原因的复发性流产占50％左右，临床上统一归类为原因不明的复发性流产。近年来随着免疫学的研究进展，由免疫因素引起的复发性流产逐渐被国内外同行接受认可，并认为是主要原因之一。随着生殖医学及人工助孕技术的广泛开展，目前一致接受胚胎的生长发育与免疫耐受密切相关，其过程多种免疫分子参与其中，并影响正常胚胎着床及胚胎免疫排斥导致流产的发生。

近年来随着社会发展，食品、辐射、空气质量等因素对人体的影响，复发性流产的发病率逐年升高，母体及胚胎原因导致早期妊娠组织丢失问题逐渐得到有效解决，但仍有近1/2的复发性流产病人的原因不明，导致这样的病人无法从病因上得到有效的治疗，怎样做到早发现及胚胎发育停止提前预测，及应用某种药物来干预复发性流产的发生或评价某种药物的治疗效果，成为目前的研究热点。

人体内存在数量庞大的微生物群，这些微生物编码基因的数量是人类基因组的100倍之多。宿主的黏膜表面基本都被微生物覆盖，其中大部分微生物位于肠道内，参与机体新陈代谢、神经认知功能、炎症反应和免疫调控等多项生理过程，其代谢能力与人体的肝脏相当，因此被看作人体的又一个器官。近年来随着高通量测序技术以及组学技术的发展，人们逐渐认识到肠道微生物可以影响疾病发生，参与调控疾病治疗相关的代谢、免疫、炎症等多个过程。研究与不明原因复发性流产相关的肠道菌群，对于实现复发性流产的早发现以及胚胎发育的提前预测具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于发现与复发性流产相关的肠道菌群，通过检测所述菌群的丰度，可以在疾病早期进行预警以及干预，提高生活质量，加强防护。

本发明提供了微生物标志物在制备诊断复发性流产的产品的应用，所述微生物标志物为anaerococcushydrogenalis。

进一步，所述产品通过测定样本中微生物标志物的丰度来判断是否为复发性流产，其中anaerococcushydrogenalis的丰度显著增加时，可以预测或诊断为复发性流产。

进一步，所述样本为阴道分泌物样本。

进一步，所述复发性流产为不明原因复发性流产。

进一步，所述产品可以包括本领域常用的任何物质，优选的为试剂盒、制剂、芯片。

进一步，所述产品为试剂盒。

本发明提供了一种诊断复发性流产的试剂盒，所述试剂盒包括检测anaerococcushydrogenalis的丰度的试剂。

进一步，所述试剂包括检测anaerococcushydrogenalis的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

进一步，所述特异性引物为能够扩增anaerococcushydrogenalis16srrna的引物。

进一步，所述试剂盒还包括pcr预混液。

本发明提供了anaerococcushydrogenalis在构建预测复发性流产的计算模型中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了anaerococcushydrogenalis与复发性流产相关，anaerococcushydrogenalis在不明原因复发性流产患者中丰度显著增加，说明anaerococcushydrogenalis可作为检测靶标应用于复发性流产的诊断和预测。

本发明提供了一种诊断复发性流产的试剂盒，所述试剂盒能在疾病早期进行诊断，实现早期预警，提高患者的生活质量。

附图说明

图1是anaerococcushydrogenalis在不明原因复发性流产患者中的丰度图。

具体实施方式

本发明通过将正常妊娠的人群和不明原因复发性流产的人群作为对象，首次查明了肠内细菌与不明原因复发性流产的临床医学指标的相关性，并以此为基础提供了不明原因复发性流产的早期诊断技术。

为了评估肠道共生菌群组成能否作为不明原因复发性流产的预测因子，本发明通过收集正常人群与不明原因复发性流产的阴道分泌物，综合分析16srrna测序、宏基因组测序和针对特定菌群的定量聚合酶链反应结果，发现与复发性流产相关的肠道菌群，本发明通过16srrna测序，首次发现了anaerococcushydrogenalis的丰度在复发性流产和正常人群中呈现显著性差异，说明anaerococcushydrogenalis可作为复发性流产诊断的生物标记物。

在本发明中，“生物标记物”是指，将发生复发性流产的人的试样与对照组试样进行比较时，由于在两个试样中存在有差别而可以成为预测复发性流产的危险程度或者诊断是否发生疾病时的基准的物质。

在本申请中，“预测危险程度”是指辨别个体是否存在复发性流产的可能性，其可以为了通过对发生复发性流产危险程度高的个体进行特别且适当的管理，推迟发病时间或尽可能杜绝发病，或者为了治疗决定，选择最合适的治疗方式而应用于临床。此外，“诊断”的意思是确认病理状态的存在或特征，针对本发明的目的，诊断的意思可以是复发性流产发病与否。

根据本发明的实施例，分析不同肠道菌群的复发性流产的阴道分泌物样本。基于高通量测序数据，对不同菌群对复发性流产的效果进行统计，从而确定与复发性流产相关的特异性序列。

作为一种优选的实施方案，包括以下步骤：

(1)样品的收集与处理：收集相关阴道分泌物样本，使用试剂盒进行dna提取，得到核酸样本；

(2)文库构建和测序：利用高通量测序进行dna文库构建和测序，以便得到样品中所包含微生物的核酸序列；

(3)通过生物信息学的分析方法确定复发性流产相关的特异性微生物核酸序列。

首先，获得所述个体的阴道分泌物样本中的核酸序列的测序数据，所述测序数据包括多个读段；组装所述读段，获得基因集，所述基因集包括多个组装片段，所述基因集中的组装片段为非冗余序列；确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段；依据所述测序数据，分别确定所述基因集中的各个组装片段的丰度，其中包括，分别确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段的丰度；分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定各种微生物的丰度。

在本发明中，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如pgm，合成测序的技术平台比如illumina公司的hiseq、miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如pacbio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段。

在本发明中，所称的组装可以利用已知序列组装方法或软件进行，例如利用soapdenovo、velvet等。

根据本发明的一个实施例，通过将基因集中的组装片段与微生物参考序列运用软件metagenemark比对，依据与某种微生物参考序列的相似程度来判断组装片段是否来自该种微生物。所称参考序列指预先确定的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，若目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择ncbi数据库中的各种微生物的参考基因组和或metahit项目公开的dacc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，确定复发性流产标志物中的各种微生物包含的组装片段包括：将所述基因集中的组装片段分别与所述各种微生物的参考序列进行比对，确定与一种微生物的参考序列的相似性大于或者等于90％的组装片段来自该种微生物。

根据本发明的一个实施例，所称的分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定所述结核病标志物中的各种微生物的丰度的步骤中，微生物的丰度为该种微生物包含的所有组装片段的丰度的中位数或者平均数。

试剂盒

在某些实施方案中，本文提供的是用于检测一种或多种微生物标志物的丰度的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种微生物标志物特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、基因分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含用识别微生物特异性蛋白质的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测微生物标志物：实时定量反转录pcr、生物芯片检测法、dna印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

本发明的微生物标志物用于诊断不明原因复发性流产患者时，若anaerococcushydrogenalis丰度显著高于正常水平时，则表示已发生复发性流产或者发生复发性流产的危险程度高。

在本发明中，作为能够检测出提供为生物标记物的微生物或测定微生物丰度的制剂或试剂，可以使用能够特异性检测出特异性存在于样本内相应微生物的诸如蛋白、核酸、脂质、糖脂质、糖蛋白或糖(单糖类、二糖类、低聚糖类等)等之类的有机生物分子的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体、抗体等。

作为一个例子，本发明中，能够检测出上述微生物或测定微生物水平的制剂或试剂可以是能够检测出相应微生物的引物。上述引物优选特异性检测出相应微生物的目标核酸(比如，16srrna)，并且不与其他微生物的基因组序列进行特异性结合。

在本申请中，用语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。在本申请中，用语“16srrna”是指构成原核生物核糖体的30s小亚单位的rrna，其一方面碱基序列的大部分被高度保留，另一方面部分区域显示出高的碱基序列多样性。特别是在同种之间几乎不存在多样性而异种间显示出多样性，因此通过比较16srrna的序列，能够有效鉴定原核生物。

作为一个实施方式，在本发明中，上述引物可以用于扩增相应微生物中保留的16srrna的序列，扩增序列后，通过期望的产物的生成与否，能够检测出微生物的存在或测定微生物水平。利用引物的序列扩增方法可以使用本领域已知的多种多样的方法。例如，可以使用聚合酶链式反应(pcr)、逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)、多重pcr、降落(touchdown)pcr、热启动(hotstart)pcr、巢式(nested)pcr、增效(booster)pcr、实时(real-time)pcr、差示pcr(differentialdisplaypcr：dd-pcr)、cdna末端快速扩增(rapidamplificationofcdnaends：race)、反向(inverse)聚合酶链式反应、载体介导(vectorette)pcr、热不对称交错pcr(tail-pcr(thermalasymmetricinterlacedpcr))、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制(self-sustainedsequencereplication)、目标碱基序列的选择性扩增反应，但本发明的范围不限于此。

此外，在本发明中，检测出微生物或测定微生物水平的制剂可以是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应微生物或测定微生物水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(elisa(enzymelinkedimmunosorbentasay))、放射免疫分析(ria：radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(immunoprecipitationassay)、补体结合分析法(complementfixationassay)、荧光活化细胞分选器(facs(fluorescenceactivatedcellsorter))、蛋白芯片(proteinchip)等，但不限于此。

除此之外，可以将本领域广泛使用的分子免疫学方法用于本发明的检测微生物或测定微生物水平。

本文中使用的术语“样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是阴道拭子。

在本发明中，目标核酸指的是针对其设计探针或引物的染色体的片段、具有或者不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的片段或部分或者核酸序列。目标核酸可以包括：野生型序列；含突变、删除或复制的核酸序列；串联重复区；所关注的基因；所关注的基因的区域或者其任何上游区域或下游区域。目标核酸可以表示特定基因的替代序列或等位基因。目标核酸可以从基因组dna、cdna或rna获得。本文中使用的目标核酸可以是天然dna或经pcr扩增的产物。在一个实施方式中，目标核酸是来自细菌种群的16s核糖体rna基因的片段。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1筛选与不明原因复发性流产相关的肠道菌群

1、样本的采集

选取早期妊娠不明原因复发性流产患者16例作为实验组(ursa)，选取同期正常妊娠妇女20例作为对照组，后者经过严格匹配。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，获得了伦理委员会的审核与批准。

2、16srrna测序

2.1dna的提取

使用dna提取试剂盒自阴道分泌物中提取细菌dna，操作步骤按说明书进行。

2.2dna样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna。

2.3pcr扩增及产物纯化

采用transgenap221-02(transstartfastpfudnapolymerase)进行pcr扩增反应，全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，同一样本的pcr产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶回收pcr产物，tris-hcl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。

2.4荧光定量

将pcr产物用quantifluor^tm-st蓝色荧光定量系统(promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

2.5miseq文库构建

使用truseqtmdnasampleprepkit进行文库的构建，具体步骤按照说明书进行。

2.6miseq测序

以dna片段为模板，pcr合成目标待测dna片段，cbot上进行桥式pcr扩增，生成dna簇，hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。

3、数据分析

3.1数据预处理

使用flash、trimmomatic等软件对miseq测序得到的pereads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用usearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多out，采用rdpclassifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的otu进行生物信息统计分析，并使用silva数据库进行比对。

3.2肠道菌群物种差异分析

使用lefse多级物种差异判别分析进行差异物种的筛选，首先使用non-parametricfactorialkruskal-wallis(kw)sum-ranktest(非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验)检测具有显著丰度差异特征，并找到与丰度有显著性差异的类群。最后，采用线性判别分析(lda)来估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小。筛选标准lda>2且p<0.05。

4、结果

结果显示，与对照组相比，anaerococcushydrogenalis的丰度在不明原因复发性流产的患者中显著增加，差异具有统计学意义(p＝0.04345)，提示anaerococcushydrogenalis可以作为生物标记物应用于复发性流产的诊断。

实施例2不明原因复发性流产的诊断试剂盒的制备

根据anaerococcushydrogenalis与不明原因复发性流产的相关性，可以通过检测样本中anaerococcushydrogenalis的丰度来诊断不明原因复发性流产，据此本发明提供了一种基于检测anaerococcushydrogenalis丰度的诊断不明原因复发性流产的试剂盒。试剂盒组分如下：dna提取试剂、特异性检测anaerococcushydrogenalis16srrna的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶逆转录酶、dnase、rnase抑制剂、depc-水、无菌水、sybrgreen荧光染料。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。