鉴定皂荚性别的基因组合、SSR引物组合、鉴定方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学dna分子标记检测技术领域，具体涉及鉴定皂荚性别的基因组合、ssr引物组合、鉴定方法和应用。

背景技术：

皂荚gleditsiasinensislam.系豆科苏木亚科皂荚属植物(2n＝28)，为我国重要的乡土树种之一。皂荚可以用于环境防护、园林绿化，还能作为经济树种和木料使用。不仅如此，皂荚具有很高的药用价值，中国药典收录皂角(大皂荚与猪牙皂)与皂角刺为皂荚药用部位；皂角刺所含黄酮类、甾类等药用成分在治疗肿瘤方面发挥着重要作用；大皂角中所含的皂甙除了抗癌、抗病毒等功效还具有有去污和发泡的能力，已经成为天然的化妆和洗涤用品的制作原料，具有很高的经济价值。

ssr(simplesequencerepeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellitedna)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个ssr两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。与其它分子标记相比，ssr标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。ssr分子标记电泳结果分辨率高，稳定性妤，易于测序，被广泛使用于遗传多样性分析等分子生物学领域，但现有技术并未有关于ssr分子标记应用于植物性别鉴别研究的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供鉴定皂荚性别的基因组合、ssr引物组合、鉴定方法和应用，采用本发明提供的基因组合能够鉴定皂荚的性别。

本发明提供了鉴定皂荚性别的基因组合，所述基因组合包括g1基因、g2基因、g3基因、g4基因和g5基因；

所述g1～5基因依次具有seqidno.1～5所示的核苷酸序列。

本发明还提供了扩增上述技术方案所述基因组合的ssr引物组合，所述ssr标记引物组合包括：gs-ssr-f1引物、gs-ssr-r1引物、gs-ssr-f2引物、gs-ssr-r2引物、gs-ssr-f3引物、gs-ssr-r3引物、gs-ssr-f4引物、gs-ssr-r4引物、gs-ssr-f5引物和gs-ssr-r5引物；

所述gs-ssr-f1引物具有seqidno.6所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-r1引物具有seqidno.7所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-f1引物和gs-ssr-r1引物扩增g1基因；

所述gs-ssr-f2引物具有seqidno.8所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-r2引物具有seqidno.9所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-f2引物和gs-ssr-r2引物扩增g2基因；

所述gs-ssr-f3引物具有seqidno.10所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-r3引物具有seqidno.11所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-f3引物和gs-ssr-r3引物扩增g3基因；

所述gs-ssr-f4引物具有seqidno.12所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-r4引物具有seqidno.13所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-f4引物和gs-ssr-r4引物扩增g4基因；

所述gs-ssr-f5引物具有seqidno.14所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-r5引物具有seqidno.15所示的核苷酸序列，所述gs-ssr-f5引物和gs-ssr-r5引物扩增g5基因。

本发明还提供了利用上述技术方案所述的ssr引物组合鉴定皂苷性别的方法，包括：

以皂荚基因组dna为模版，用所述ssr引物分别进行pcr扩增，分别得到扩增产物；当所述扩增产物的分子量同时分别为186bp、305bp、266bp、150bp和260bp时，皂荚为雌性，否则为雄性。

优选的，所述皂荚为皂荚叶。

优选的，所述pcr扩增的体系每25μl包括：浓度为150ng/μl的基因组dna1μl，dntp2μl，浓度为10μm/l的gs-ssr-f1μl，浓度为10μm/l的gs-ssr-r1μl，10×buffer2.5μl，taq酶0.5μl，浓度为2.5mm/ml的氯化镁溶液1.5μl和ddh2o15.5μl。

优选的，所述pcr扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。

本发明还提供了上述技术方案所述的基因组合在鉴定皂荚性别中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的ssr引物组合在鉴定皂荚性别中的应用。

本发明提供了鉴定皂荚性别的基因组合，采用本发明提供的基因组合能够鉴定皂荚的性别。

本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的基因组合能够鉴定皂荚的性别，准确率为100％。

附图说明

图1为成功引物扩增雌雄样品琼脂糖电泳胶图，其中，m为makerdl200(takara)，27代表34995_1引物(g1基因)，34代表64130_1引物(g2基因)，36代表78763_1引物(g3基因)，39代表147508_1引物(g4基因)，41代表1467_1引物(g5基因)，zc1-zc5代表雌株；zx1-xz5代表雄株；

图2为已知性别皂荚琼脂糖电泳图，其中，m为makerdl200(takara)，27代表34995_1引物(g1基因)，34代表64130_1引物(g2基因)，36代表78763_1引物(g3基因)，39代表147508_1引物(g4基因)，41代表1467_1引物(g5基因)，cz代表雌株；xz代表雄株。

具体实施方式

本发明提供了鉴定皂荚性别的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括g1基因、g2基因、g3基因、g4基因和g5基因；所述g1～5基因依次具有seqidno.1～5所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述基因组合能够鉴定皂荚的性别。

在本发明中，所述g1基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：

ctccttgtttagtgtgcagcttttagaaaatactgaagaataggagcatgcatcacacacatgaagactgtatgtcgcttgtatcaattttatgcaaatgtatacgcgtacgtaagcgagcgaggagcagcagcacaggtcgtccgaggacacgtaacttagctacggagctgtccaatgtatgcatgcaagtatggctattcaacaaatccattttcctggctactcgactctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctccctctgtcttttctactggtaaactgctctgcttctacggcaatatccactgacttctcaccttctgccgcgttggctattcgaactttgctaacaaaatttgaatctttctcacgagtttgaccttgtctgctttggtacgttagaatgacgagtgatggttatttataatgatttgtgcaagtgcttaatttctcataaaaattaattttatggttttattacgacaacgtac。

在本发明中，所述g2基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：

aagagcgacgttacggtgctctaccgcgccactattcgactcctcgacgacaccgaaatcatccactgcgactttcaggtacgtctactgccctctccccctttcaactcttttcaacttttcctacttttcctacttttgcttttatcgaatgatgaaaacgacacgtgtttgaagagagagagagagagagagagagagagagagcttgcgacaagtggcctactctctcctaccaacttgcaccaagttttacttgatgcatggataattcaagtgcgagctcattttttatttttttaagtcgcgagcttttttcatgcgatcatgcgatggctttttctgacgtatcaacgcaaacgtgtgtgcgattgtctgtgtatgtttgtacttgtgtgcacgcgcgcgtctacgtgtgtatgtgtacaacatcgattttctcgtgcgttttcttcgttttcttcgttttcatcgtcgtcgtcgtcgtc。

在本发明中，所述g3基因具有seqidno.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：

actttaactggacactgtttttctatgtaagtacttttcatgattacctagattacctagatggacccgtgatgtcaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacataatcttagtgaaaatgttaatgatttcattctctcgcgttaatgggtggtagttgagtaagtcagtatagcattcgttagatcatttgaatcttcaaggaagtaggaagaatgtttttacaaaacttgtaccaacgctttacaaaagtaaactcacctacttcaactcctacaaaccagaaataccagcacggacagaacctgatgacttcgagttaccatcatgcacccaaacaccttgtaaaatccttctcccaggaactagtattctagtattatctatgtaagttgttggcattgttggacgcgattaaagaactgagtttgacacattaaacaactaatcaattttttaatcaccta。

在本发明中，所述g4基因具有seqidno.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：

gaggcagtaggggcaaaagttggctgcgagtaataattcgccgataaattgcgttacgccacgttatatgaatgtgtggaattatacgcgagttacgtcggcgtagggggaaaatgagagagagagagagagagagagagagagagagaaagaggctgtattgtatcgccggcgatgccaatagtgcaaactcacgtcgtatttgtgtaatggctagtaaggcttcccttgcgtatcctgtgaccaacctcgactcgattaccttttgtcgttgatcgatgcttcgagtagttggattttccttgactattttttttcttccctattttcatgctaaacgcacttattaatgagaaaaatcacgttatactcgtgtaaaatttaatttcaagcgaaagctttttgcgttattgccgaaagtaagttg。

在本发明中，所述g5基因具有seqidno.5所示的核苷酸序列，具体序列如下：

cacaatgatcgggtcttcgtgtcggaacgacctgcattttacaaaaggcatgcagccaaggaccgtcaaatcaaatcaaatgaaaaggcctaccgatgaaataagccacggggataaagaatacgtcatccctcgggccacaaagtggactgaaagtcccagtcaacacatacctaacacgtacaggccagatttcttcatctggttcacaaagtagatgagttgggcggcagagcgtgggttggacaccatgagcaacatttggggtcgccagaacttgacatgatccttgcgagagtccaacatgagcaggtattttctaacctggggaaagaagggaaagtgaacagggtgaagcaacaaaactaactttttccaaagtgtgataaagacgctgcgcgccggcacttttttttactttttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgtagctgtgtagctgcaccgagagcgcttgtgatggtctctagccaaaattagttgacccgtcccaaaccggagtcaaccttcatgaggacctgtgctttacttttaaaacatcttaaacacagtt。

本发明还提供了扩增上述技术方案所述基因组合的ssr引物组合，所述ssr标记引物组合包括：gs-ssr-f1引物、gs-ssr-r1引物、gs-ssr-f2引物、gs-ssr-r2引物、gs-ssr-f3引物、gs-ssr-r3引物、gs-ssr-f4引物、gs-ssr-r4引物、gs-ssr-f5引物和gs-ssr-r5引物。

在本发明中，所述gs-ssr-f1引物具有seqidno.6所示的核苷酸序列，具体序列如下：

cgtccgaggacacgtaactt；

所述gs-ssr-r1引物具有seqidno.7所示的核苷酸序列，具体序列如下：

gccgtagaagcagagcagtt。

在本发明中，所述gs-ssr-f1引物和gs-ssr-r1引物扩增g1基因。

在本发明中，所述gs-ssr-f2引物具有seqidno.8所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

tcatccactgcgactttcag；

在本发明中，所述gs-ssr-r2引物具有seqidno.9所示的核苷酸序列，具体序列如下：

acgtttgcgttgatacgtca；

在本发明中，所述gs-ssr-f2引物和gs-ssr-r2引物扩增g2基因。

在本发明中，所述gs-ssr-f3引物具有seqidno.10所示的核苷酸序列，具体序列如下：

ttacctagatggacccgtga；

所述gs-ssr-r3引物具有seqidno.11所示的核苷酸序列，，具体序列如下：

ggttctgtccgtgctggtat。

在本发明中，所述gs-ssr-f3引物和gs-ssr-r3引物扩增g3基因。

在本发明中，所述gs-ssr-f4引物具有seqidno.12所示的核苷酸序列，具体序列如下：

gcgttacgccacgttatatg；

在本发明中，所述gs-ssr-r4引物具有seqidno.13所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

aggttggtcacaggatacgc。

在本发明中，所述gs-ssr-f4引物和gs-ssr-r4引物扩增g4基因。

在本发明中，所述gs-ssr-f5引物具有seqidno.14所示的核苷酸序列，具体序列如下：

cttgcgagagtccaacatga；

在本发明中，所述gs-ssr-r5引物具有seqidno.15所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

catgaaggttgactccggtt。

在本发明中，所述gs-ssr-f5引物和gs-ssr-r5引物扩增g5基因。

在本发明中，所述引物设计思路：利用primer3v2.3.6(untergasseretal.2012)分别对搜索到的多态性>2的cluster内的ssr序列针对位点两端设计引物；扩增目标片段长度控制在100～400bp，扩增目标片段位置为重复序列前1个碱基到重复序列后5个碱基，其他参数默认。对所有设计得到的引物进行筛选，筛选标准如下：(1)设计引物的ssrs类型为非单核苷酸重复模体、非复合重复模体；(2)仅选取每条read上有一个ssr的ssrs类型设计引物，以避免扩增过程中扩增出第二条ssr影响多态性。(2)设计的引物必须在某一个clusters内，且clusters内ssrs的长度多态性≥2；(3)每一条设计的引物在clusters中必须有两条引物支持(避免测序错误)；(4)去除完全相同的引物结果。

本发明还提供了利用上述技术方案所述的ssr引物组合鉴定皂苷性别的方法，包括：以皂荚基因组dna为模版，用所述ssr引物分别进行pcr扩增，分别得到扩增产物；当所述扩增产物的分子量同时分别为186bp、305bp、266bp、150bp和260bp时，皂荚为雌性，否则为雄性。

在本发明中，所述皂荚为皂荚叶。本发明对所述皂荚叶基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用常规提取方法即可。

在本发明中，所述pcr扩增的体系每25μl优选包括：浓度为150ng/μl的基因组dna1μl，dntp2μl，浓度为10μm/l的gs-ssr-f1μl，浓度为10μm/l的gs-ssr-r1μl，10×buffer2.5μl，taq酶0.5μl，浓度为2.5mm/ml的氯化镁溶液1.5μl和ddh2o15.5μl。

在本发明中，所述pcr扩增的程序优选包括：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。

本发明还提供了上述技术方案所述的基因组合在鉴定皂荚性别中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的ssr引物组合在鉴定皂荚性别中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的鉴定皂荚性别的基因组合、ssr引物组合、鉴定方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

本实施例提供五种用于鉴定皂荚性别的基因序列，该基因序列的获取方法为:

1.采用百泰克新型快速植物基因组dna提取试剂盒对采集自焦作博爱的皂荚雄性植株雌性植株进行dna提取。

具体步骤为：

(1)加热bufferp1到65℃预热灭菌去离子水。

(2)取适量植物组织在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。

(3)转移细粉(植物新鲜组织100mg或干重组织30mg)到一个1.5ml离心管，不要解冻，加入550μl65℃预热bufferp1(已经加入β-巯基乙醇至0.2％)和4μlrnasea剧烈涡旋振荡混匀1分钟，室温放置10分钟。

(4)加入130μl的bufferp2，充分混匀，12000rpm离心3分钟。

(5)小心吸取上清到一个分离柱a，注意不要吸到界面物质，12,000rpm离心1分钟，收集下液。

(6)加入1.5倍体积的bufferp3立刻轻柔涡旋，充分混匀。

(7)将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱ac中，(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

(8)加入700μl漂洗液wb(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心1分钟，弃掉废液。

(9)加入500μl漂洗液wb，12,000rpm离心1分钟，弃掉废液。

(10)将吸附柱ac放回空收集管中，13,000rpm离心3～5分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(11)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热)，室温放置3～5分钟，12,000rpm离心1分钟收集dna。

(12)dna可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

2.按照bsa(bulkedscgcrantanalysis，群体分离分析方法)将采集博爱的5份雌株和雄株分别混合建库，构建雄性dna池与雌性dna池。

3.进行ssr-pcr扩增及检测。ssr-pcr扩增体系及扩增程序由本实验室预先优化方法获得(具体引物如表1所示)：

ssr-pcr扩增体系如下：

浓度为150ng/μl的基因组dna1μl，dntp2μl，浓度为10μm/l的gs-ssr-f1μl，浓度为10μm/l的gs-ssr-r1μl，10×buffer2.5μl，taq酶0.5μl，浓度为2.5mm/ml的氯化镁溶液1.5μl和ddh2o15.5μl。

ssr-pcr扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。

表1ssr引物列表

pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，具体步骤如下：

1.制备1％琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml):称取0.7g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中，加入70ml(50ml)1×tae，瓶口倒扣小烧杯，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0％琼脂糖凝胶液。

2.胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×tae电泳缓冲液至没过胶板1～2㎜为止。

3.加样：在点样板上混合dna样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x。用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。

加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60～100v，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5ug/ml的溴化乙锭1×tae溶液染色约20min，再用清水漂洗10min。

观察照相:在紫外灯下观察，dna存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存，得到图1。

实施例2

本实施例对实施例1获得的基因序列以及按照该基因序列设计的ssr引物进行性別鉴定的正确性验证，具体验证方法如下。

1.用已知性别植株进行引物正确性验证，dna提取方法与ssr-pcr扩增体系同实施例1。

用采自卫河边人工栽培已知性别的植株(雌雄株各五株)进行验证，结果如图2所示，ssr引物准确的对10株已知性别的植株进行了区分，5株雄株跑胶结果无特异性条带。图2中m为makerdl200(takara)，27代表34995_1引物(g1基因)，34代表64130_1引物(g2基因)，36代表78763_1引物(g3基因)，39代表147508_1引物(g4基因)，41代表1467_1引物(g5基因)，cz代表雌株；xz代表雄株。若分别检测得到长度为186、305、266、150、260bp的单一片段为雌性，未检测到长度为186、305、266、150、260bp的单一片段为雄性。

2.综合以上结果，应用本发明获取的基因组合序列及所提供的ssr引物组合可以100％对人工栽培及不同地区皂荚性别进行准确鉴定。

g1基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：

ctccttgtttagtgtgcagcttttagaaaatactgaagaataggagcatgcatcacacacatgaagactgtatgtcgcttgtatcaattttatgcaaatgtatacgcgtacgtaagcgagcgaggagcagcagcacaggtcgtccgaggacacgtaacttagctacggagctgtccaatgtatgcatgcaagtatggctattcaacaaatccattttcctggctactcgactctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctccctctgtcttttctactggtaaactgctctgcttctacggcaatatccactgacttctcaccttctgccgcgttggctattcgaactttgctaacaaaatttgaatctttctcacgagtttgaccttgtctgctttggtacgttagaatgacgagtgatggttatttataatgatttgtgcaagtgcttaatttctcataaaaattaattttatggttttattacgacaacgtac。

g2基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：

aagagcgacgttacggtgctctaccgcgccactattcgactcctcgacgacaccgaaatcatccactgcgactttcaggtacgtctactgccctctccccctttcaactcttttcaacttttcctacttttcctacttttgcttttatcgaatgatgaaaacgacacgtgtttgaagagagagagagagagagagagagagagagagcttgcgacaagtggcctactctctcctaccaacttgcaccaagttttacttgatgcatggataattcaagtgcgagctcattttttatttttttaagtcgcgagcttttttcatgcgatcatgcgatggctttttctgacgtatcaacgcaaacgtgtgtgcgattgtctgtgtatgtttgtacttgtgtgcacgcgcgcgtctacgtgtgtatgtgtacaacatcgattttctcgtgcgttttcttcgttttcttcgttttcatcgtcgtcgtcgtcgtc。

g3基因具有seqidno.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：

actttaactggacactgtttttctatgtaagtacttttcatgattacctagattacctagatggacccgtgatgtcaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacataatcttagtgaaaatgttaatgatttcattctctcgcgttaatgggtggtagttgagtaagtcagtatagcattcgttagatcatttgaatcttcaaggaagtaggaagaatgtttttacaaaacttgtaccaacgctttacaaaagtaaactcacctacttcaactcctacaaaccagaaataccagcacggacagaacctgatgacttcgagttaccatcatgcacccaaacaccttgtaaaatccttctcccaggaactagtattctagtattatctatgtaagttgttggcattgttggacgcgattaaagaactgagtttgacacattaaacaactaatcaattttttaatcaccta。

g4基因具有seqidno.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：

gaggcagtaggggcaaaagttggctgcgagtaataattcgccgataaattgcgttacgccacgttatatgaatgtgtggaattatacgcgagttacgtcggcgtagggggaaaatgagagagagagagagagagagagagagagagagaaagaggctgtattgtatcgccggcgatgccaatagtgcaaactcacgtcgtatttgtgtaatggctagtaaggcttcccttgcgtatcctgtgaccaacctcgactcgattaccttttgtcgttgatcgatgcttcgagtagttggattttccttgactattttttttcttccctattttcatgctaaacgcacttattaatgagaaaaatcacgttatactcgtgtaaaatttaatttcaagcgaaagctttttgcgttattgccgaaagtaagttg。

g5基因具有seqidno.5所示的核苷酸序列，具体序列如下：

cacaatgatcgggtcttcgtgtcggaacgacctgcattttacaaaaggcatgcagccaaggaccgtcaaatcaaatcaaatgaaaaggcctaccgatgaaataagccacggggataaagaatacgtcatccctcgggccacaaagtggactgaaagtcccagtcaacacatacctaacacgtacaggccagatttcttcatctggttcacaaagtagatgagttgggcggcagagcgtgggttggacaccatgagcaacatttggggtcgccagaacttgacatgatccttgcgagagtccaacatgagcaggtattttctaacctggggaaagaagggaaagtgaacagggtgaagcaacaaaactaactttttccaaagtgtgataaagacgctgcgcgccggcacttttttttactttttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgttgtagctgtgtagctgcaccgagagcgcttgtgatggtctctagccaaaattagttgacccgtcccaaaccggagtcaaccttcatgaggacctgtgctttacttttaaaacatcttaaacacagtt。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的基因组合能够鉴定皂荚的性别，准确率为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河南师范大学

<120>鉴定皂荚性别的基因组合、ssr引物组合、鉴定方法和应用

<141>2018-12-24

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>516

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctccttgtttagtgtgcagcttttagaaaatactgaagaataggagcatgcatcacacac60

atgaagactgtatgtcgcttgtatcaattttatgcaaatgtatacgcgtacgtaagcgag120

cgaggagcagcagcacaggtcgtccgaggacacgtaacttagctacggagctgtccaatg180

tatgcatgcaagtatggctattcaacaaatccattttcctggctactcgactctctctct240

ctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctccctctgtcttttctactgg300

taaactgctctgcttctacggcaatatccactgacttctcaccttctgccgcgttggcta360

ttcgaactttgctaacaaaatttgaatctttctcacgagtttgaccttgtctgctttggt420

acgttagaatgacgagtgatggttatttataatgatttgtgcaagtgcttaatttctcat480

aaaaattaattttatggttttattacgacaacgtac516

<210>2

<211>488

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aagagcgacgttacggtgctctaccgcgccactattcgactcctcgacgacaccgaaatc60

atccactgcgactttcaggtacgtctactgccctctccccctttcaactcttttcaactt120

ttcctacttttcctacttttgcttttatcgaatgatgaaaacgacacgtgtttgaagaga180

gagagagagagagagagagagagagagcttgcgacaagtggcctactctctcctaccaac240

ttgcaccaagttttacttgatgcatggataattcaagtgcgagctcattttttatttttt300

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