双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用的制作方法

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。

背景技术：

罗非鱼是世界范围内广泛养殖的水产品之一，据不完全统计，2014年，中国罗非鱼养殖产量达到169.85万吨，占全球养殖总产量的32％左右。近年来，罗非鱼链球菌病日益严重，已给罗非鱼养殖业造成严重的经济损失。研究表明罗非鱼链球菌病的主要致病菌是无乳链球菌和海豚链球菌，近几年危害最严重的是无乳链球菌病，无乳链球菌是一种人、畜和鱼共患的致病菌，其能感染海鲷、罗非鱼等多种海淡水鱼类发病，造成较高的死亡率。海豚链球菌同样是一种能引起鱼类发生感染和死亡的病原菌。海豚链球菌、无乳链球菌均能引起鱼类的败血症、脑膜炎等病症，从外部症状和两种病原菌的菌落、菌体形态上都很难准确判断是由哪一种链球菌引起的，这将严重影响到对病害的有效处理。

目前罗非鱼链球菌的常规诊断方法都很难满足对感染鱼样本快速诊断的要求，同时一些生理反应现象可能随外界环境的变化而改变，也极易导致误判情况的发生。普通pcr一次仅能检测1个基因，可能会造成漏检或误检。荧光抗体技术和elisa费用昂贵且较需要熟练的技术操作；lamp则存在假阳性现象；定量pcr则需要昂贵的仪器、专业的操作以及存在成本高等不足。因此，要达到对患病鱼的快速诊断，需要建立高度特异、敏感、快速的罗非鱼链球菌早期分子诊断技术。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物。

本发明的另一目的在于提供一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法。

本发明利用无乳链球菌和海豚链球菌的特异性鉴别基因，分别设计了特异性引物，采用双重pcr技术对两种链球菌进行快速检测。通过对双重pcr检测体系的优化，开发了针对无乳链球菌和海豚链球菌双重pcr检测技术的试剂盒，同时，建立了检测准确，高效的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，包括如下引物序列：

针对无乳链球菌16srdna基因的pcr引物：

p-1：5'-ataccgcataagagtgatt-3'；

p-2：5'-accacctgtcacttctgct-3'；

针对海豚链球菌sip基因的pcr引物：

p-3：5'-tgaataagaaattgtttttagcg-3'；

p-4：5'-acttgtaatcgttggttctgcc-3'。

本发明提供一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，包括上述引物p-1、p-2、p-3和p-4。

所述的试剂盒，还包括pcr反应试剂。

本发明提供上述引物或试剂盒在非疾病诊断中鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。

本发明还提供一种双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法，包括如下步骤：所述的方法为非疾病诊断方法；

(1)取待检样品；

(2)加入含有上述引物p-1、p-2、p-3和p-4的反应混合液和待检样品，配成双重pcr反应体系混合液；进行双重pcr反应于一个反应程序；

(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测检测液是否出现特异的dna条带，出现则判定为阳性，阳性表示待检样品中含有无乳链球菌或/和海豚链球菌；没有出现特异性条带的则判定为阴性，阴性表示不含有无乳链球菌和海豚链球菌；其中，出现870bp片段的为无乳链球菌，出现614bp片段的则为海豚链球菌。

所述的双重pcr反应体系为：1μl的待检样品，各2μm的引物p-1、p-2、各1.6μm的引物p-3、p-4，10×buffer(无mg²⁺)缓冲液2.5μl，1.5mm的mgcl2，2.5mm的dntp，0.5u的rtaqdnapolymerase，depc补充至25μl。

所述的双重pcr反应程序为：95℃预变性5min，94℃30sec，54℃30sec和72℃30sec的30个循环，最后72℃延伸10min；

所述的待检样品包括但不限于无乳链球菌和海豚链球菌的基因组dna、菌落和含有无乳链球菌和海豚链球菌的组织样品；

所述的待检样品还可以为鱼的血液、脑、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉。

无乳链球菌与海豚链球菌的16srdna基因的同源性达到96.6％～96.8％，同源性较高，可在变异区设计特异性引物对其进行区分和鉴定。表面免疫源性蛋白sip(surfaceimmunogenicprotein，sip)属于编码b群链球菌的表面蛋白基因类群，在不同种的血清型菌株中都有存在。本发明拟选用sip基因和16srdna基因部分序列，通过引物组合优化建立一种快速、高效、稳定、特异性好、灵敏度高的无乳链球菌和海豚链球菌双重pcr检测方法，旨在为无乳链球菌和海豚链球菌的快速检测和早期预警提供一种准确、高效的检测技术，为链球菌病的准确诊断、检疫提供理论依据。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明最短在1.5h内即可完成所有检测操作，简单快速，解决了现有技术检测无乳链球菌和海豚链球菌存在的周期长、操作复杂、检测成本高等问题；

(2)检测成本低，只需两对引物，操作简便，适合多样本的同时检测；

(3)检测所需样品量少，仅需取少量鱼血或组织即可进行检测。

(4)本发明还可以用于水体中无乳链球菌和海豚链球菌的检测及鉴定。

(5)本发明所用的两对特异性引物，是根据无乳链球菌的16srdna基因和海豚链球菌的sip基因序列设计的。按照本发明的方法可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌，对无乳链球菌、海豚链球菌、无乳链球菌和海豚链球菌混合物可分别扩增出870bp、614bp、870bp和614bp的特异性条带。对6株鱼体常见病原菌和一株大肠杆菌进行特异性分析，仅无乳链球菌和海豚链球菌能分别扩增出16srdna和sip两条特异性条带，其他7株菌无特异性片段。本发明建立的检测方法可检测到基因组含量分别为9.84×10^-5ng/μl的无乳链球菌和9.30×10^-5ng/μl的海豚链球菌，以及菌液浓度为2.76×10²cfu/ml的无乳链球菌和2.51×10²cfu/ml的海豚链球菌；用所建立的双重pcr检测方法对人工同时感染无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼的肾脏进行pcr检测，可获得870、614bp的特异性片段，检出率100％。本方法在罗非鱼样品检测过程中快速准确具有较高的特异性、灵敏度、重复性和稳定性，可实现罗非鱼链球菌病的早期分子预警，应用前景广阔，为罗非鱼链球菌病的快速诊断、流行病学调查等提供了准确而有效的手段。

附图说明

图1是双重pcr检测无乳链球菌和海豚链球菌的特异性琼脂糖凝胶电泳；其中，m代表dna2000bp大小标记；泳道1和泳道2分别代表了无乳链球菌atcc13813和海豚链球菌atcc29178参考菌株，泳道3同时含有这两个细菌；泳道4～10分别为嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的基因组dna。

图2是特异引物对无乳链球菌和海豚链球菌的dna灵敏度；其中，m代表dna2000bp大小marker，n为阴性对照；1～5分别代表无乳链球菌(s.agalactiae)dna浓度9.84×10^-2、9.84×10^-3、9.84×10^-4、9.84×10^-5、9.84×10^-6ng/μl和海豚链球菌(s.iniae)的dna浓度9.30×10^-2、9.30×10^-3、9.30×10^-4、9.30×10^-5、9.30×10^-6ng/μl。

图3是特异引物对无乳链球菌和海豚链球菌的菌落灵敏度；其中，m代表dna2000bp大小marker，n为阴性对照；1～5分别代表无乳链球菌菌液浓度2.76×10⁶、2.76×10⁵、2.76×10⁴、2.76×10³、2.76×10²、27.6cfu/ml和海豚链球菌菌液浓度2.51×10⁶、2.51×10⁵、2.51×10⁴、2.51×10³、2.51×10²、25.1cfu/ml。

图4是双重pcr对无乳链球菌和海豚链球菌的重复性检测的琼脂糖凝胶电泳；其中，m代表dna2000bp大小标记，1～5：模板dna为无乳链球菌和海豚链球菌的dna样本；6：模板dna为标准菌株dna样本。

图5是人工同时感染无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼的肾脏组织扩增的pcr产物；其中，m代表dna2000bp的marker，1和2、3和4、5和6分别代表6条人工感染无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼肾脏组织扩增的pcr结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本发明所用的主要试剂及仪器：

dna提取试剂、dntp、10×pcrbuffer、mg²⁺、goldview和taqdna等分子试剂购买于北京天根生化有限公司；脑心浸液培养基(bhi)、营养琼脂粉均购买于广东环凯微生物科技有限公司。pcr仪(abi公司，美国)，凝胶成像仪(bio-rad公司，美国)，核酸电泳仪(bio-rad公司，美国)，nanodrop2000c超微量分光光度计(赛默科技，美国)。

实施例中所用的无乳链球菌(streptococcusagalactiae)atcc13813购自上海康朗生物科技有限公司，海豚链球菌(strepstococcusiniae)atcc29178购自中国微生物菌种保藏中心，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)bncc186123、创伤弧菌(vibriovulnificus)bncc186281、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)bncc185983和大肠杆菌(escherichiacoli)bncc336902购自北纳生物，迟钝爱德华氏菌(edwardsiellatarda)atcc15947购自上海北诺生物科技有限公司，维氏气单胞菌(aeromonasveronii)atcc35624购自上海沪峥生物科技有限公司，温和气单胞菌(aeromonassobria)atcc43979购自中国微生物菌种保藏中心。

实施例1双重pcr快速检测无乳链球菌和海豚链球菌方法的建立

(1)模板制备：从-80℃保存的菌种中挑取无乳链球菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌在无菌条件下接种于脑心浸液琼脂培养基上，于28℃进行恒温培养，24h后分别收集培养菌菌体，参考革兰氏阳性菌dna提取方法提取各种细菌的基因组dna，采用dna提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取其基因组dna，用作反应模板；

(2)引物设计合成：根据genbank中无乳链球菌16srdna部分序列设计引物p-1和p-2，预期扩增目的片段大小为870bp。海豚链球菌特异性基因sip的序列，设计引物p-3和p-4，预期扩增片段大小为614bp。

引物序列如下：

p-1：5'-ataccgcataagagtgatt-3'；

p-2：5'-accacctgtcacttctgct-3'；

p-3：5'-tgaataagaaattgtttttagcg-3'；

p-4：5'-acttgtaatcgttggttctgcc-3'。

(3)双重pcr反应体系：25μl反应体系混合液是1μl的模板，引物p-1、p-2(100μm)、引物p-3、p-4引物(100μm)分别对应体积为(0.5μl、0.5μl)和(0.4μl、0.4μl)，10×buffer(无mg²⁺)缓冲液2.5μl，mgcl2(25mm)1.5μl，dntp(25mm)2.5μl，rtaqdnapolymerase(5u/μl)0.1μl，depc补充至25μl；

(4)双重pcr反应程序：95℃预变性5min，94℃30sec)，54℃(30sec)和72℃(30sec)的30个循环，最后72℃延伸10min；

(5)双重pcr的特异性检测：以步骤(1)中的无乳链球菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌和大肠杆菌的dna为模板，检验双重pcr技术的特异性，1.2％琼脂糖凝胶电泳结果如图1，无乳链球菌基因组dna样品扩增的条带为870bp；海豚链球菌基因组dna扩增出614bp的特异条带；无乳链球菌和海豚链球菌基因组dna混合样品则同时扩增出870bp和614bp的条带；而嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、维氏气单胞菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌的dna为模板进行扩增，均未出现任何条带。

实施例2双重pcr检测无乳链球菌和海豚链球菌的dna灵敏度，包括如下步骤：

(1)分别取活化的无乳链球菌和海豚链球菌的菌液2～3ml，用商业化的dna抽提试剂盒提取dna，用分光光度计测定其浓度；

(2)将无乳链球菌基因组dna分别稀释为9.84×10^-2、9.84×10^-3、9.84×10^-4、9.84×10^-5、9.84×10^-6ng/μl，将海豚链球菌的基因组dna分别稀释为9.30×10^-2、9.30×10^-3、9.30×10^-4、9.30×10^-5、9.30×10^-6ng/μl。

(3)如图2所示，无乳链球菌和海豚链球菌的dna灵敏度分别为9.84×10^-5ng/μl和9.30×10^-5ng/μl。

实施例3双重pcr检测无乳链球菌和海豚链球菌的单细菌灵敏度，包括如下步骤：

(1)分别取活化的无乳链球菌和海豚链球菌菌液，用0.9％的生理盐水洗两遍，按十倍梯度稀释，涂板计数；

(2)将无乳链球菌菌液浓度分别稀释为2.76×10⁶、2.76×10⁵、2.76×10⁴、2.76×10³、2.76×10²、27.6cfu/ml，将海豚链球菌菌液浓度分别稀释为2.51×10⁶、2.51×10⁵、2.51×10⁴、2.51×10³、2.51×10²、25.1cfu/ml。

(3)采用实施例1的体系和程序，将上述制备的菌液煮沸10min，取上清液作为待检样品的模板；

(4)如图3所示，无乳链球菌和海豚链球菌的纯菌物的灵敏度分别为2.76×10²cfu/ml和2.51×10²cfu/ml。

实施例4双重pcr检测无乳链球菌和海豚链球菌方法的重复性，包括如下步骤：

(1)对5株已鉴定为无乳链球菌和5株已鉴定为海豚链球菌的菌株进行菌株基因组dna提取；

(2)采用实施例1的体系和程序，每个阳性dna样本重复检测3次，以标准菌株atcc13813和atcc29178的dna样本作为模板dna设置为阳性对照。

(3)如图4所示，5份不同的阳性dna样本为模板均能同时扩增出两条特异性条带，与标准对照结果的扩增结果相同，三次重复性检测的结果完全一致。

实施例5双重pcr检测无乳链球菌和海豚链球菌人工感染的应用，包括如下步骤：

(1)取6尾人工同时感染无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼的肾脏组织；

(2)采用实施例1的体系和程序，分别以这6尾鱼的肾脏作为模板；

(4)结果如图5所示，6尾人工同时感染无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼肾脏样本，双重pcr都同时扩增出870bp和614bp的特异条带，阳性检出率为100％。

本发明的两对引物是经过筛选得到的，首先根据无乳链球菌和海豚链球菌表达环磷酸腺苷因子的cfb(cyclicadenosinemonophosphatefactor)基因、表面免疫相关蛋白的sip(surfaceimmunogenicprotein)基因、溶血素的hly(hemolysin)基因、疫苗抗原a的vaa(vaccineantigena)基因、热休克引诱的丝氨酸蛋白酶的htra(hightemperaturereguirementa)基因、纤维蛋白原结合蛋白的fbp(fibrinogenbingdingprotein)基因和表达16s核糖体rna的16srdna(16sribosomaldna)的七个基因在无乳链球菌(s.agalactiae)和海豚链球菌(s.iniae)中的差异性设计了70对引物，经过pcr，筛选出了14对引物可以扩出条带，然后根据14对引物的退火温度、片段大小和基因特异性，对无乳链球菌(s.agalactiae)选择16srdna基因和对海豚链球菌(s.iniae)挑选sip基因。

筛选出的14对引物的序列如下：

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用

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