一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法与流程

本发明涉及一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法，属于生物技术领域，适用于蜜蜂及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测。

背景技术：

蜜蜂美洲幼虫腐臭病（americanfoulbrood，afb）和欧洲幼虫腐臭病（europeanfoulbrood，efb）是两种能引起蜜蜂幼虫死亡的细菌性、急性、毁灭性传染病，能导致蜜蜂幼虫的大批死亡，最终导致整个蜂群的灭亡，危害巨大。农业部和质检总局联合制定的最新的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》将二者列为二类传染病。世界动物卫生组织（oie）也将其列入检疫名录，列为进出口蜜蜂及蜂产品检疫对象。

美洲幼虫腐臭病是目前危害蜜蜂幼虫生长的最主要细菌病之一，轻者降低蜂群繁殖和采集力，重者导致蜂群的覆灭。该病传播迅速、为害严重，发生后就很难治愈，难以根除，而且经常复发，尤其是1日龄的蜜蜂幼虫对幼虫芽孢杆菌非常敏感，一旦感染很快就会死亡。

欧洲幼虫腐臭病是一种蜜蜂幼虫的恶性传染病，传播快、危害大，可引起幼虫大批死亡。患病蜂群不能正常采蜜和繁殖，蜂群减弱甚至覆没。通过流行病学调查，目前没有发现哪一种蜜蜂对欧洲幼虫腐臭病有抵抗力，东方蜜蜂比西方蜜蜂更易感染，尤其中蜂发病更为严重。

美洲幼虫腐臭病的病原体为蜜蜂幼虫芽孢杆菌（paenibacilluslarvae，pl），是一种芽孢形式的革兰氏阳性细菌。产生的芽孢有7层结构包围，这种特殊构造使得幼虫芽孢杆菌的芽孢具有特别强的生命力，对热、化学物质等有极强的抵抗力，在高温干燥等恶劣环境下至少能存活35年。悬浮在蜂蜜中的芽孢阳光照射下能存活4周-6周。幼虫芽孢杆菌这种对外界环境超强的抵抗力使得他可在蜂蜜、蜂王浆、蜂胶和蜂花粉中存活很长时间。蜜蜂欧洲幼虫腐臭病是由蜂房蜜蜂球菌（melissococcuspluton，mp）引起的，该菌是一种革兰氏阳性菌，但有染色特性不稳定性，有时候可能为革兰氏阴性菌，兼性厌氧。蜂房蜜蜂球菌对外界不良环境有特别强的抵抗力，在巢脾或蜂蜜内能存活1年左右，在室温和干燥条件下可存活17个月，也可在蜂蜜、蜂王浆、蜂胶和蜂花粉中存活，可以通过蜜蜂和蜂产品传播。

近年来，随着蜜蜂和蜂产品的国际贸易逐渐增多，由此带来的蜜蜂疫病安全问题日益受到各方关注。

我国对蜂病的研究不多，除对蜜蜂重要疫病生物学、流行病学及蜂群疫病诊断方面开展一些研究外，而对于蜂产品中蜂类病原的检测研究几乎是空白。根据原国家质检总局的要求，今后要加强蜂产品中蜂类病原的检测，尤其是对蜜蜂美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病加强检疫，以防蜂病通过产品传入国内。

针对进口蜂产品的检测，目前主要集中在药物残留、生产加工卫生和掺假等质量安全方面的问题，尤其是对抗生素残留和生产加工过程中的人为污染控制严格，而对于蜂产品中可能携带的蜂类病原缺少足够的重视。由于对蜜蜂使用抗生素的控制，一些卫生管理条件不好的养蜂场由于管理不善而导致蜂类疫病流行，而有些病原可以通过蜂蜜等产品进行传播，这就加大了病原传入的风险。同时由于近年来蜂产品进口量越来越大，其中相当一部分为未加工的蜂蜜原料，传播蜂病的可能性更高。因此，非常有必要对进口蜂产品实施蜂类疫病检测，制订有效的检测方法。

所以本发明建立了一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法，可以同时检测这两种蜜蜂最重要的病原菌，应用于蜜蜂及蜂产品的快速检测，对于保护国内养蜂业的健康发展，防止疫病传入，促进蜂产品国际贸易的发展具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法，用于蜜蜂及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测，具有灵敏性高、特异性强、经济和便捷的特点，能够满足目前蜜蜂疫病诊断和进出口蜂产品检疫需求。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr引物，包括用于扩增蜂房蜜蜂球菌特异片段的上游引物mp-f、下游引物mp-r和扩增蜜蜂幼虫芽孢杆菌特异片段的上游引物pl-f、下游引物pl-r，各引物核苷酸序列如下：

上游引物mp-f：5’-agaagagtggcggacgggtga-3’；

下游引物mp-r：5’-accgtcacgaggaaaacagttactc-3’；

上游引物pl-f：5’-gccaaggaagaacggccaggg-3’；

下游引物pl-r：5’-ccacctctgcgtgctggcaa-3’。

本发明的另一目的在于提供一种基于上述检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌双重pcr引物的检测方法，包括以下步骤：

（1）双重pcr反应体系配置：2×pcrmastermix12.5μl，10μmol/l上下游引物mp-f和mp-r各0.5μl，10μmol/l上下游引物pl-f和pl-r各0.75μl，待测样品dna2μl，然后加入去离子水8.0μl，使反应总体积为25.0μl。

（2）双重pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性45s，64℃退火30s，72℃变性45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

（3）pcr扩增产物检测分析与判定：取8μlpcr扩增产物，在加入0.01%gelred核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶上电泳后，在凝胶成像系统上检测pcr扩增产物后进行结果判定：

当所述双重pcr扩增产物中含有大小为401bp的条带，则所述待测样品含有蜂房蜜蜂球菌；

当所述双重pcr扩增产物中含有大小为706bp的条带，则所述待测样品含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；

当所述双重pcr扩增产物中同时含有大小为401bp的条带和706bp的条带，则所述待测样品同时含有蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌；

当所述双重pcr扩增产物中不含有大小为401bp的条带且不含有大小为706bp的条带，则所述待测样品不含有蜂房蜜蜂球菌且不含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌。

本发明具有以下优点：

（1）良好的稳定性和特异性：本发明系通过大量的blast比对分析，筛选了蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌高度保守、特异的基因序列；通过对多组引物进行比较后选定的两对最佳引物；通过调整退火温度来进一步提高反应的特异性，本方法对蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测具有高度特异性，相互之间及与其它蜜蜂致病菌无交叉反应，另外还具有较好的重复性；

（2）灵敏度高：本发明通过对引物比例和退火温度的多次优化，进一步提升其灵敏度，检测两种靶基因的灵敏度均能达到1pg/μl，而且同步性良好；

（3）双重检测，省时省力，检测成本低：蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌作为蜜蜂最重要也是最常见的致病菌，根据临床症状不易区分，需要通过病原鉴别，利用本发明可以一次检测两种病原菌，全部反应在2个小时内完成，省时省力。同时，利用本发明不需要昂贵的荧光pcr仪，也不需要合成昂贵的探针及相应的试剂，检测成本低，操作简便，利于基层部门实验室应用推广。

附图说明

图1为实施例1的蜂房蜜蜂球菌特异性引物梯度退火温度pcr扩增后电泳结果。其中m：100bpladderdnamarker；1～8退火温度分别为50℃、51℃、53℃、55.9℃、59.3℃、62.1℃、64.1℃、65℃。

图2为实施例1的蜜蜂幼虫芽孢杆菌特异性引物梯度退火温度pcr扩增后电泳结果。其中m：100bpladderdnamarker；1～8退火温度分别为50℃、51℃、53℃、55.9℃、59.3℃、62.1℃、64.1℃、65℃。

图3为实施例2的蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法的引物比例和退火温度优化结果。引物浓度：10μmol/l上下游引物mp-f和mp-r1～20均为0.5μl；10μmol/l上下游引物pl-f和pl-r：1～5分别为0.6μl、6～10分别为0.75μl、11～15分别为0.9μl、16～20分别为1.0μl。退火温度：1、6、11、16为58℃；2、7、12、17为60℃；3、8、13、18为62℃；4、9、14、19为64℃；5、10、15、20为66℃。

图4为实施例4的蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法的特异性测定结果。其中1：蜂房蜜蜂球菌；2：蜂房蜜蜂球菌+蜜蜂球囊菌；3：蜂房蜜蜂球菌+蜜蜂副伤寒杆菌；4：蜂房蜜蜂球菌+黄曲霉菌；5：蜂房蜜蜂球菌+东方蜜蜂微孢子虫；6：蜂房蜜蜂球菌+蜜蜂幼虫芽孢杆菌；7：蜂房蜜蜂球菌+蜜蜂幼虫芽孢杆菌模式菌；8：蜜蜂幼虫芽孢杆菌；9：蜜蜂幼虫芽孢杆菌+蜜蜂球囊菌；10：蜜蜂幼虫芽孢杆菌+蜜蜂副伤寒杆菌；11：蜜蜂幼虫芽孢杆菌+黄曲霉菌；12：蜜蜂幼虫芽孢杆菌+东方蜜蜂微孢子虫。

图5为实施例5的蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法的灵敏性测定结果。其中m：100bpladderdnamarkeri；1～8蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌模板dna浓度分别为1μg/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料中除蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂幼虫芽孢杆菌等菌株由专门机构提供外，如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1：

一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr引物，包括用于扩增蜂房蜜蜂球菌特异片段的上游引物mp-f、下游引物mp-r和扩增蜜蜂幼虫芽孢杆菌特异片段的上游引物pl-f、下游引物pl-r，各引物核苷酸序列如下：

上游引物mp-f：5’-agaagagtggcggacgggtga-3’；

下游引物mp-r：5’-accgtcacgaggaaaacagttactc-3’；

上游引物pl-f：5’-gccaaggaagaacggccaggg-3’；

下游引物pl-r：5’-ccacctctgcgtgctggcaa-3’。

如图1和图2所示，在50℃～65℃的退火温度内，二者均具有良好的扩增效果。

实施例2：

蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法的引物比例和退火温度优化结果：

（1）双重pcr反应体系配置：2×pcrmastermix12.5μl，10μmol/l上下游引物mp-f和mp-r各0.5μl，10μmol/l上下游引物pl-f和pl-r各0.60μl～0.75μl，待测样品dna2μl，然后补充去离子水使反应总体积为25.0μl。

（2）双重pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性45s，58℃～66℃退火30s，72℃变性45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

（3）优化结果：引物比例和退火温度优化结果如图3所示，当引物比例为1∶1.5，退火温度为64℃时，二者扩增效果相一致，电泳条带也较亮，所以反应体系中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的引物量分别为0.5μl和0.75μl，最佳退火温度为64℃。

实施例3：

利用本发明提供的检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr引物优化的检测方法，包括以下步骤：

（1）双重pcr反应体系配置：2×pcrmastermix12.5μl，10μmol/l上下游引物mp-f和mp-r各0.5μl，10μmol/l上下游引物pl-f和pl-r各0.75μl，待测样品dna2μl，然后加入去离子水8.0μl，使反应总体积为25.0μl。

（2）双重pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性45s，64℃退火30s，72℃变性45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

（3）pcr扩增产物检测分析与判定：取8μlpcr扩增产物，在加入0.01%gelred核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶上电泳后，在凝胶成像系统上检测pcr扩增产物后进行结果判定：

若所述双重pcr扩增产物中含有大小为401bp的条带，则所述待测样品含有蜂房蜜蜂球菌；

若所述双重pcr扩增产物中含有大小为706bp的条带，则所述待测样品含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；

若所述双重pcr扩增产物中不含有大小为401bp的条带且不含有大小为706bp的条带，则所述待测样品不含有蜂房蜜蜂球菌且不含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌。

实施例4：

蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法的特异性测定：

分别以蜜蜂球囊菌、蜜蜂副伤寒杆菌、黄曲霉菌和东方蜜蜂微孢子虫等4种常见的蜜蜂病原菌（寄生虫）为样品，按常规方法提取dna后分别与蜂房蜜蜂球菌或蜜蜂幼虫芽孢杆菌搭配加样，以实施例3的方法进行pcr反应和结果判定，由图4可知，仅蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌（模式菌）产生特异性的目的条带，说明本试剂盒具有较强的特异性。

实施例5：

蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法的灵敏性测定：

分别以含有蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌目的片段的质粒为模板，进行10倍递增稀释到相应的浓度后加入到反应体系中，以实施例3的方法进行pcr反应和结果判定，由图5可知，pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌1pg/μl模板仍能扩增出明显的dna条带，证实了本发明的双重pcr检测方法中2个靶目标的灵敏度均能达到1pg/μl，具有较好的灵敏性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重pcr检测方法

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