一种类器官球体的高通量培养方法与流程

本发明属于医疗器械领域，涉及一种类器官球体的高通量培养方法。

背景技术：

癌症一直是影响全球人体健康的最主要的因素。近几年癌症相关的靶向新药与肿瘤免疫新疗法的研发越来越多。但以患者作为研究对象的研究具有不可操控性，而实验动物与人差异巨大实验结果迁移难度大，2D细胞系培养缺乏体内微环境失去了肿瘤部分特性因而结果不准确。目前这些问题导致了从基础到临床的转化效率极低，肿瘤类器官的兴起为转化医学提供了全新的技术平台。肿瘤类器官是从单个肿瘤样本中培养的类器官，该模型很好的保留了肿瘤异质性，同时能够进行扩增，冷冻保存及基因改造，因此目前建立了大规模的肿瘤类器官库。肿瘤类器官研究已经成为肿瘤基础和临床研究中的重要工具，对揭示肿瘤发生发展的机制、快速评估肿瘤药物与免疫细胞的治疗效果意义重大。

但是目前肿瘤类器官的制作及药物筛选仍提留在小规模的实验室研究阶段，制作方法高度依赖实验员的技术，实验结果不可控性较大，同时将制作好的肿瘤类器官转移至96孔或者384孔中费时费力，操作过程也不可控，易造成类器官大小不一，各孔类器官数目不统一等不可控因素导致实验结果不准确。

微流控技术是一项在微米尺度空间对流体进行操控的技术，以其高通量、高灵敏度、低消耗等优点备受研究者关注，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。微流控技术主要应用流体的层流和液滴现象。微流控能够以非常高的通量制备高度单分散性的液滴乳液。常见的微通道结构为T型和ψ型。在某些情况下，含有不同高分子聚合物的水相液体在微流控通道中也会形成不互溶的液滴。

3D生物打印机是一种能够在数字三维模型驱动下，按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官等制品的装备。

而目前肿瘤类器官制备的过程不可控，制备得到的器官不均一，随实验人员的操作不同而变化，还需要手动挑选适合大小、结构的器官，并且需要手动将培养成熟的类器官转移至96/384孔板等高通量培养载体中，耗时费力。

CN108486035A公开了一种三维类器官的液滴培养方法，该方法将移液枪头与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织。通过对移液枪头剪截位置、注入液体体积、液滴与截面间的接触角角度等因素的筛选分析，获得了比较理想的类器官液滴培养条件。同时，可以通过对上述条件的适时调整，对三维类器官的形态(形状和大小)进行灵活有效的控制。此外，该方法还具有操作简便、培养成本低廉、培养效率高等优点，培养制备的毫米级三维类器官组织可满足在个性化治疗早期进行体外药物筛选的需要。但是这种方法仍然存在需要实验人员操作的问题，可能会造成培养的不均一。

目前，还没有方法将微流控技术与3D打印平台共同使用来进行高通量制造和培养类器官。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种类器官的高通量培养方法，以解决现有的细胞系培养结果不准确、类器官制备不均一不可控、类器官分配不方便的问题。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种类器官球体的高通量培养方法，所述高通量培养方法包括以下步骤：

(1)将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到类器官球体；

(2)将步骤(1)中得到的类器官球体加热后与3D打印平台联动并将类器官球体进行分配，而后进行培养类器官球体。

本发明提供的高通量培养方法，以类器官为生物墨水，利用液滴现象，通过微流控生成类器官后结合3D打印平台，能够简便、快速、精确的将类器官打印至培养载体中，这个过程不随操作人员的变化而变化，类器官的大小和结构合适、均一可控，每个培养载体的培养腔内类器官数量固定，并且能够自动化打印2种以上的不同类器官，同时实现药物敏感性测试和毒性测试，相比于2D细胞系培养缺乏体内微环境失去了肿瘤部分特性导致预测结果不准确，本发明的高通量培养方法结果更为准确。

本发明提供的高通量培养方法，可以得到类器官球体，而现有的方法得到的类器官一般不均一，可能会产生成团等现象，不能够明确分配均匀，无法得到类器官球体。

本发明所述类器官可以是肿瘤类器官、肝脏类器官、心脏类器官、肾脏类器官等等。

本发明所述高通量培养方法的含义为：能一次将类器官球体直接均匀地分散于多块96孔/384孔板中培养，并能进行后续快速药物筛选实验。

本发明所述联动的含义为：三通装置与3D打印平台连成一个整体，共同实时运行。

优选地，步骤(1)所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到。

优选地，所述细胞的个数为1.0×10⁵～1.0×10⁷个，例如可以是1.0×10⁵个、1.0×10⁶个、2.0×10⁶个、3.0×10⁶个、4.0×10⁶个、5.0×10⁶个、1.0×10⁷个等，优选为2.0×10⁶个。

在本发明中，细胞的个数不能过高或者过低，如果细胞个数过低，则细胞几乎不能够生长；如果细胞的个数过高，则会使得形成的球体易爆。

优选地，所述细胞为原代细胞。

本发明所述原代细胞经过提取得到。原代细胞提取方法：通过手术或穿刺得到的癌组织或动物组织，4度条件下剪切成1mm左右的小块，利用I型胶原酶在37度细胞培养箱中消化1小时，利用100μm滤网过滤细胞，利用红细胞裂解液裂解红细胞，离心并用培养基重悬细胞，细胞计数后备用。

优选地，所述基质胶的体积为20～200μL，例如可以是20μL、40μL、60μL、80μL、90μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL或200μL等，优选为100μL。

优选地，所述混合的温度为2～8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，优选为4℃。

在本发明中，氟油能够更好的产生液滴现象，对于含细胞的基质胶能够产生良好的液液界面张力和剪切力作用，使得含细胞的基质胶流体形成高度均一的间断流，而氟油与含细胞的基质胶会形成乳液，通过这种微流控的方法，自下而上的将类器官剪切包裹成球体，使得最终可形成类器官球体。

优选地，步骤(1)所述通入的方法为注射。

本发明所述通入的方法不仅限于注射，任何可以将两种液体加入到三通中的方法均适用于本发明。

优选地，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。

在本发明中，注射装置一般通过管道与三通装置的其中两个管道连接，三通装置的另一个管道用来转移形成的类器官球体。

优选地，所述含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min，例如可以是1μL/min、5μL/min、10μL/min、15μL/min、16μL/min、17μL/min、18μL/min、19μL/min、20μL/min、21μL/min、22μL/min、23μL/min、24μL/min、25μL/min、30μL/min、40μL/min、50μL/min、60μL/min、80μL/min、100μL/min等，优选为20μL/min；

优选地，所述氟油的流速为1～500μL/min；例如可以是1μL/min、5μL/min、10μL/min、20μL/min、30μL/min、40μL/min、45μL/min、46μL/min、47μL/min、48μL/min、49μL/min、50μL/min、51μL/min、52μL/min、53μL/min、54μL/min、55μL/min、100μL/min、150μL/min、200μL/min、300μL/min、400μL/min、500μL/min等，优选为50μL/min。

优选地，所述注射装置的温度为2～8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，优选为4℃。

优选地，所述管道的直径为200～1000μm，例如可以是200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm等，优选为800μm。

优选地，步骤(2)中所述加热的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等，优选为37℃。

在本发明中，步骤(2)中加热的过程使得类器官球体凝固，如果不经过加热过程，类器官则不能够形成规则的球体形状，影响其均一稳定可控的效果。

优选地，步骤(2)中所述分配为：将类器官球体分配至高通量培养载体中。

优选地，所述高通量培养载体包括96孔板或384孔板。

在本发明中，步骤(2)的分配过程能够将类器官球体精确地分配进每个孔板或者微反应器内，并且数量固定。在分配的过程中，氟油会挥发，因此仅剩下最终形成的类器官球体。

优选地，步骤(2)中所述3D打印平台的打印速度为0.5～0.9s/孔；优选为0.7s/孔。

优选地，步骤(2)中所述培养的培养基为改良的(Advanced)DMEM/F12培养基。

优选地，所述改良的DMEM/F12培养基含有生长因子。

优选地，所述高通量培养方法包括以下步骤：

(1)将1.0×10⁵～1.0×10⁷个细胞与20～200μL基质胶在2～8℃下混合得到含细胞的基质胶，然后将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个温度为2～8℃的注射装置中，分别通过直径为200～1000μm的管道注射进三通装置中得到类器官球体；其中含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min，氟油的流速为1～500μL/min；

(2)将步骤(1)中得到的类器官球体在35～40℃下加热后，与3D打印平台联动，并按照0.5～0.9s/孔的打印速度分配至高通量培养载体中，氟油挥发，而后加入改良的DMEM/F12培养基进行培养类器官球体。

示例性的，三通装置可置于4℃环境中(例如4℃冰箱)，注射装置可选用常用的注射器，这样可共同看作成为一个微泵注射器，氟油与含细胞的基质胶在三通装置中混合并成型，经过加热后，输送到3D打印平台中，在3D打印平台中进行分配，其中氟油会在分配过程中直接挥发。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的高通量培养方法，以类器官为生物墨水，利用液滴现象，通过微流控生成类器官后结合3D打印平台，能够简便、快速、精确的将类器官打印至培养载体中，这个过程不随操作人员的变化而变化，类器官的大小和结构合适、均一可控，每个培养载体的培养腔内类器官数量固定，通常为1个，并且能够自动化打印2种以上的不同类器官，同时实现药物敏感性测试和毒性测试，相比于2D细胞系培养缺乏体内微环境失去了肿瘤部分特性导致预测结果不准确，本发明的高通量培养方法结果更为准确，应用前景良好，具有非常高的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例1中类器官球体在96孔板中的分布图。

图2是本发明实施例2中类器官球体12×8矩阵排列图。

图3是本发明提供的一种类器官球体的高通量制备的装置示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明所用的基质胶品牌：R&D systems，货号：3533-010-02。

本发明所述改良的(Advanced)DMEM/F12培养基组成：20％胎牛血清，100ng/mL Noggin，50ng/mL FGF4,50ng/mL FGF-basic,200ng/mL R-spondin 1。

实施例1

本实施例提供一种类器官球体的高通量培养方法，包括以下步骤：

(1)利用原代细胞提取方法提取原代细胞，细胞计数；在4℃环境中将2.0×10⁶个原代细胞与100μL基质胶充分混匀，注入1mL注射器中，另外一个注射器注入氟油，分别将氟油和基质胶分别置于两个注射泵中并放入4℃冰箱；注射器分别连接直径为800μm的聚四氟乙烯(PTFE)管，两管汇合至聚二甲基硅氧烷(PMDS)三通装置中，然后三通装置连接另外一根直径800μm的PTFE管，整个平台置于4℃冰箱中；含基质胶注射泵流速20μL/min，含氟油注射泵流速50μL/min，生成均匀的类器官球体；

(2)将类器官球体通过PTFE管经过一个37℃加热装置后连接于3D打印平台；3D打印平台按照0.7s/孔的速度，均匀的将类器官球体分装于96孔板中，分装过程中氟油挥发；凝固后的类器官球体加入含生长因子的改良的DMEM/F12培养基中培养。

打印出的类器官球体如图1所示。由图1可以看出，每个孔板中类器官球体的数量均一，分布均匀，性能稳定。打印过程中使用的装置示意图如图3所示，但可用于本发明类器官球体的高通量制备的装置示意图不仅限于这一种。

实施例2

本实施例提供一种类器官球体的高通量培养方法，包括以下步骤：

(1)利用原代细胞提取方法提取原代细胞，细胞计数；在4℃环境中将5.0×10⁶个原代细胞与200μL基质胶充分混匀，注入1mL注射器中，另外一个注射器注入氟油，分别将氟油和基质胶分别置于两个注射泵中并放入4℃冰箱；注射器分别连接直径为800μm的聚四氟乙烯(PTFE)管，两管汇合至聚二甲基硅氧烷(PMDS)三通装置中，然后三通装置连接另外一根直径800μm的PTFE管，整个平台置于4℃冰箱中；含基质胶注射泵流速25μL/min，含氟油注射泵流速55μL/min，生成均匀的类器官球体；

(2)将类器官球体通过PTFE管经过一个37℃加热装置后连接于3D打印平台；3D打印平台按照0.8s/孔的速度，均匀的将类器官球体分装成为12×8矩阵排列，分装过程中氟油挥发；凝固后的类器官球体加入含生长因子的改良的DMEM/F12培养基中培养。

打印出的类器官球体如图2所示。由图2可以看出，类器官球体在培养皿中分布规则、均匀，数量均一。

实施例3

本实施例提供一种类器官球体的高通量培养方法，包括以下步骤：

(1)利用原代细胞提取方法提取原代细胞，细胞计数；在4℃环境中将1.0×10⁶个原代细胞与80μL基质胶充分混匀，注入1mL注射器中，另外一个注射器注入氟油，分别将氟油和基质胶分别置于两个注射泵中并放入4℃冰箱；注射器分别连接直径为600μm的聚四氟乙烯(PTFE)管，两管汇合至聚二甲基硅氧烷(PMDS)三通装置中，然后三通装置连接另外一根直径600μm的PTFE管，整个平台置于4℃冰箱中；含基质胶注射泵流速15μL/min，含氟油注射泵流速45μL/min，生成均匀的类器官球体；

(2)将类器官球体通过PTFE管经过一个37℃加热装置后连接于3D打印平台；3D打印平台按照0.5s/孔的速度，均匀的将类器官球体分装于96孔板中，分装过程中氟油挥发；凝固后的类器官球体加入含生长因子的改良的DMEM/F12培养基中培养。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例原代细胞的个数为3.0×10⁷个，其余均与实施例1相同。

由于细胞数过多，基质胶粘稠度增加，氟油所产生的剪切力不足以匀速快速切割基质胶，导致形成的类器官球体大小不一，同时形成的球体不易交连成型，易破损。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例原代细胞的个数为0.1×10⁵个，其余均与实施例1相同。

由于细胞数过低，细胞之间相互作用降低，细胞生长较慢，不能够达到快速筛选药物的目的。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中不包括加热装置而是直接连接3D打印平台。

由于不加热导致直接低落的球体粘稠度较低不易成型。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中不使用三通装置，而是直接将氟油和含原代细胞的基质胶混合。

由于没有三通装置，氟油和含原代细胞的基质胶是不相容的，会形成氟油在下，水相在上的分成。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的类器官球体的高通量培养方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。