一株荸荠内生枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株荸荠内生枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：随着生活水平的提高和消费观念的改变，人们对食品安全和生态安全愈发重视，寻求安全、有效、低毒、低残留的新型抑菌剂成为植物保护和果蔬采后保鲜研究的热点。利用有益微生物“以菌抑菌”进行生物防治和生物保鲜是现代农业可持续发展的重要策略和趋势之一，尤其利用生物防治土传病害或对植物地下器官进行贮藏保鲜是一种行之有效的措施，是植物保护和生物防腐保鲜中的重要组成部分。在生防细菌中，芽孢杆菌具有代表性，已被成功开发近50种商品制剂，主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheninformis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)等。它们可定殖于植物根际、体表或体内，通过与病原菌竞争周围营养，分泌肽类、磷脂类和多烯类等抗菌物质，或诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而对丝状真菌引起的水稻纹枯病、豆类根腐病、苹果霉心病、棉花立枯病和棉花枯萎病等起到生防效果。前人多从植物根际发掘环境微生物用于生防菌研发，其定殖能力和效率往往是影响应用效果的重要因素之一。荸荠，又名马蹄，甜脆爽口、汁多无渣，是冬春时节岭南地区的重要特色果品。荸荠的总产量不高，且由于采收期短，以鲜销为主集中上市，加之皮薄汁多，极易失水萎缩和腐烂变质，贮藏期短，无法满足市场需求，也严重制约着农民收益和荸荠产业的发展。因此，荸荠贮藏保鲜技术和产品的研究对于解决荸荠季节性生产与常年消费的矛盾十分关键。其中带泥贮藏保鲜不仅成本低廉、处理简单，而且容易大规模实施，是最重要的保鲜途径。致病性真菌侵染是荸荠储藏腐烂的最重要原因。引起荸荠贮藏期球茎腐烂的最重要真菌包括棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、尖孢镰孢霉(Fusariumoxysporum)和根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)等。传统的荸荠贮藏保鲜方法有堆藏法、陶缸藏法、细沙藏法、土藏法和窖藏法等，但由于不同采收时间、不同贮藏温度和环境微生物分布等因素对荸荠生理影响的复杂性，往往会导致贮藏效果不稳定，乃至发生大面积腐烂，贮藏失败。因此在荸荠入库贮藏前进行适合的抑菌前处理可以大大减少贮藏期微环境中的真菌密度，提高贮藏保鲜效果。CN103907674A公开了一种用于荸荠贮藏的复合保鲜剂及其制备方法，包括质量百分比为1-2％的茁霉多糖、0.2-0.4％月桂酸单甘油酯和0.01-0.03％抗坏血酸，其余是水，该技术方案通过将荸荠浸泡在复合保鲜剂中进行贮藏，但存在复合保鲜剂残留在荸荠表面的问题。CN106359568A公开了一种鲜切荸荠保鲜方法，包括步骤有：(1)将荸荠果皮的泥土去除，臭氧水浸泡，最后清水洗净；(2)将荸荠整果放入热水中浸泡；(3)将热处理后的荸荠果实自然风干；(4)将荸荠果皮去除，清水洗净；(5)将去皮后的荸荠放入含有柠檬酸、苹果酸和荸荠皮提取物的混合溶液中浸泡；(6)用壳聚糖对鲜切荸荠进行涂膜，冷风吹干；(7)将上述冷风吹干后的鲜切荸荠在20分钟内进行真空包装机封装得成品，但所述方法影响了荸荠口味，且残留严重。因此，提供一种安全、有效、低毒、低残留的新型抑菌剂用于荸荠贮藏保鲜，在现代农业领域具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一株荸荠内生枯草芽孢杆菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌是来自可食用的健康荸荠的植物内生菌，具有真菌拮抗活性高、抗菌谱广、定殖能力强、环境友好、安全性较高等优点。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为BacillussubtilisHUB0219，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，邮编510070，保藏编号为GDMCCNo:60639，保藏日期为2019年5月6日。本发明中，枯草芽孢杆菌HUB0219分离自健康荸荠球茎，菌落浅白不透明，为革兰氏阳性菌，多单生，菌株形成椭圆形芽孢，对多种常见植物病原真菌具有良好的拮抗作用，在抑制荸荠腐烂方面具有明显效果，具有开发成为农用生防菌剂和生物保鲜剂的潜力。第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的枯草芽孢杆菌在制备生防菌剂中的应用。优选地，所述枯草芽孢杆菌的浓度为(1.0-2.0)×108CFU/mL，例如可以是1.0×108CFU/mL、1.1×108CFU/mL、1.2×108CFU/mL、1.3×108CFU/mL、1.4×108CFU/mL、1.5×108CFU/mL、1.6×108CFU/mL、1.7×108CFU/mL、1.8×108CFU/mL、1.9×108CFU/mL或2.0×108CFU/mL。第三方面，本发明提供了一种生防菌剂，所述生防菌剂包括如第一方面所述的枯草芽孢杆菌。优选地，所述枯草芽孢杆菌的浓度为(1.0～2.0)×108CFU/mL，例如可以是1.0×108CFU/mL、1.1×108CFU/mL、1.2×108CFU/mL、1.3×108CFU/mL、1.4×108CFU/mL、1.5×108CFU/mL、1.6×108CFU/mL、1.7×108CFU/mL、1.8×108CFU/mL、1.9×108CFU/mL或2.0×108CFU/mL。优选地，所述生防菌剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的生防菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中，振荡培养得到种子液；(2)吸取种子液接种到发酵培养基中，发酵培养；(3)将发酵液过滤，得到所述生防菌剂。优选地，步骤(1)所述振荡培养的温度为25～35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为25～28℃。优选地，步骤(1)所述振荡培养的速度为120～200r/min，例如可以是120r/min、130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min或200r/min，优选为150～200r/min。优选地，步骤(1)所述振荡培养的时间为20～25h，例如可以是20h、21h、22h、23h、24h或25h，优选为24h。优选地，步骤(2)所述发酵培养基的pH为6.5～7.5，例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。优选地，步骤(2)所述发酵培养的温度为25～35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为25～28℃。优选地，步骤(2)所述发酵培养的时间为20～25h，例如可以是20h、21h、22h、23h、24h或25h，优选为24h。优选地，步骤(3)所述过滤采用0.22μm细菌过滤器进行。作为优选技术方案，本发明提供了一种如第三方面所述的生防菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中，载明25～35℃下以120～200r/min的速度振荡培养20～25h，得到种子液；(2)吸取种子液接种到pH为6.5～7.5的发酵培养基中，在25～35℃下发酵培养20～25h；(3)将发酵液采用0.22μm细菌过滤器过滤，得到所述生防菌剂。第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的枯草芽孢杆菌和/或如第三方面所述的生防菌剂在抑制植物病原菌中的应用。优选地，所述植物病原菌包括根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)、柑橘青霉(P.italicum)、芒果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)或玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)中的任意一种或至少两种的组合。第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的枯草芽孢杆菌和/或如第三方面所述的生防菌剂在果实保鲜中的应用。优选地，所述植物包括荸荠、柑橘、芒果或玉米中的任意一种或至少两种的组合，优选为荸荠。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的枯草芽孢杆菌HUB0219对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)、柑橘青霉(P.italicum)、芒果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)和玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)等多种常见植物病原真菌具有良好的拮抗作用；(2)本发明的枯草芽孢杆菌HUB0219在抑制荸荠贮藏过程中腐烂的发生具有明显效果，荸荠贮藏30天和60天时，完好率高达97.5％和95％；(3)本发明的枯草芽孢杆菌HUB0219有望开发成为农用生防菌和生物保鲜剂。附图说明图1为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219的菌落形态；图2为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219的革兰氏染色结果；图3为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219的芽孢染色结果；图4(A)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219对荸荠的致病性验证结果，图4(B)为图4(A)的放大结果；图5(A)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219与根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)的对峙培养结果，图5(B)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219与棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的对峙培养结果，图5(C)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219与柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)的对峙培养结果，图5(D)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219与柑橘青霉(Penicilliumitalicum)的对峙培养结果，图5(E)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219与芒果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)的对峙培养结果，图5(F)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219与玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)的对峙培养结果；图6(A)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219在荸荠上对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)的抑制效果，图6(B)为空白对照；图7(A)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219在荸荠上对棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的抑制效果，图7(B)为空白对照。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1枯草芽孢杆菌HUB0219的获取和形态学鉴定(1)菌株获取菌株HUB0219由发明人徐良雄于2016年01月14日分离自广东省乐昌市北乡镇岭子头村的健康荸荠。(2)菌株形态学鉴定将分离的菌株接种于NA固体培养基，在30℃下培养48h，单菌落形态如图1所示，菌落浅白不透明，表面干燥、扁平、不光滑，边缘不整齐、无光泽，质地均一，易挑起，没有拉丝现象；将菌落接种于LB液体培养基，30℃恒温振荡培养18-24小时，培养基变浑浊，表面没有菌膜生成。革兰氏染色后的镜检结果如图2所示，菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌，杆菌，多单生，大小为(0.5～1)×(1.5～2.5)μm；如图3所示，菌株形成椭圆形芽孢。实施例2枯草芽孢杆菌HUB0219的生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》和《常见细菌系统鉴定手册》，对HUB0219菌株的糖醇利用、硝酸盐还原大分子利用、各种酶类的利用以及生长温度、耐盐性等30项生理生化指标进行测定。该菌能够发酵利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、麦芽糖等糖类，并能利用甘油、甘露醇、肌醇等醇类，但不能利用阿拉伯糖醇、鼠李糖、乳糖等糖醇物质；具有明胶酶活性，但不具有β-半乳糖苷酶、脲酶、色氨酸脱氨酶等酶活性；不产H2S，不产吲哚物质，不能利用柠檬酸盐，但能产3-羟基丁酮。具体结果见表1的枯草芽孢杆菌HUB0219的API50CH糖醇发酵试验和API20E主要生理学特性，“+”表示阳性，“-”表示阴性。表1实施例3枯草芽孢杆菌HUB0219的分子鉴定菌株通过平板划线得到单菌落，挑取单菌落于含有2mLTSB的摇菌管中，置于28℃振荡培养至浑浊；取1mL菌液于离心管中，10000rpm离心3min后弃上清，加入50μL无菌水，振匀后于95℃保温处理2min，置于0℃冰箱中备用；根据文献记载选择通用引物27F和1492R进行菌株基因组的PCR扩增，反应体系如表2所示，反应条件为94℃预变性3min，35循环(94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸100s)，72℃延伸7min，PCR扩增引入如下：27F(SEQIDNO:1)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；1492R(SEQIDNO:2)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’.表2PCR反应体系取5μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳45min，在紫外灯下检测扩增结果；使用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0试剂盒回收DNA片段；将回收的片段送至广州艾基生物技术有限公司进行测序，测序结果在GenBank中通过BLAST比对该菌的16SrRNA序列片段SEQIDNO:3(共1396bp)，结果显示其与枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis序列的相似度(maxidentity)为100％，比对序列覆盖范围(querycover)为100％，E值为0，因此鉴定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HUB0219，鉴定结果可信。SEQIDNO:3：GAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTT.实施例4菌株保藏基于实施例1～3的形态观察、生理生化分析和分子鉴定结果，菌株HUB0219属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，将枯草芽孢杆菌BacillussubtilisHUB0219于2019年5月6日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，邮编510070，保藏编号为GDMCCNo:60639。实施例5枯草芽孢杆菌HUB0219对荸荠的致病性验证将新鲜采收的健康荸荠清洗干净，用70％乙醇浸泡1min进行表面消毒，晾干后用无菌小刀在荸荠球茎赤道上方位置切两个直径约10mm、深约3mm的切口；用无菌棉签沾取浓度为1.0×108CFU/mL的菌悬液涂满切口，以无菌水为空白对照，每种菌株处理5个荸荠，装到无菌透明饭盒中，置于25℃的暗室内培养。结果如图4(A)和图4(B)所示，接种后第4天观察荸荠发病情况，发现枯草芽孢杆菌HUB0219不感染荸荠，荸荠表皮完好，肉质硬，横切肉质为白色；接种后第10天依然未见荸荠在伤口附近发生明显的凹陷、渗液等腐烂现象。实施例6枯草芽孢杆菌HUB0219的体外抑菌实验采用平板对峙法对枯草芽孢杆菌HUB0219的真菌拮抗活性进行测试，方法为：使用内径为6mm的无菌打孔器在致病真菌菌落的边缘切割小菌饼，用无菌接种针接种致病菌小菌饼于PDA培养基距平板边缘20mm处，同时在距其20mm的位置接种2μL浓度为1.0×108CFU/mL的HUB0219菌悬液；HUB0219菌悬液的制备方法为：取单菌落菌种接种于3mLLB培养基中，28℃下150r/min振荡培养24h得到一级种子液，吸取1mL一级种子液接种到装有100mLLB培养基的三角瓶中，培养24h。28℃恒温培养4天，观察枯草芽孢杆菌HUB0219对致病真菌的拮抗效果。结果发现，枯草芽孢杆菌HUB0219对6株致病真菌均有明显的拮抗效果，其中对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)(图5(A))、柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)(图5(C))、柑橘青霉(Penicilliumitalicum)(图5(D))、芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)(图5(E))和玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)(图5(F))的体外拮抗效果优于对棘孢木霉(Trichodermaasperellum)(图5(B))的拮抗效果。实施例7荸荠整果控制性感染的抑菌实验同实施例5采用切伤接种法处理荸荠，先用无菌棉签沾取浓度为2.0×108CFU/mL的HUB0219菌液涂满切口，再取致病菌小菌饼接种到切口表面，以涂无菌水并接致病菌琼脂块为空白对照，每种细菌处理10个荸荠，装到无菌透明饭盒中，置于常温的暗室内保藏。4天后观察荸荠发病情况，统计荸荠切口的完好率和枯草芽孢杆菌HUB0219对切口腐烂的抑制率。荸荠切口完好率的计算公式为：G＝(N0-N)/N0×100％式中，G为荸荠切口完好率，N0为荸荠切口原始个数，N为荸荠切口腐烂个数；枯草芽孢杆菌HUB0219对切口腐烂的抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(100-G)％结果如图6(A)和图6(B)所示，枯草芽孢杆菌HUB0219对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)的抑制率为75％，如图7(A)和图7(B)所示，枯草芽孢杆菌HUB0219对棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的抑制率为30％。实施例8荸荠整果带泥保鲜实验采集荸荠大田的泥土，晾干后粉碎过60目筛，分成6等份，每份500g，分别向其中3份均匀喷洒125mL枯草芽孢杆菌HUB0219的菌悬液，另三份喷洒等量无菌水作为空白对照；选取大小适中、果皮完好的健康荸荠60个，分为6组，置于纸箱中，分别将上述泥土与荸荠均匀混合，封箱并置于常温暗室中贮藏，1个月后观察并记录荸荠的完好率，完好率的计算公式为：Gn＝(N0-N)/N0×100％式中，Gn为荸荠在保鲜n天时的完好率，N0为荸荠原始个数，N为荸荠腐烂个数。实验结果显示，添加枯草芽孢杆菌HUB0219菌悬液的处理组，荸荠贮藏30天和60天时，完好率分别为97.5％和95％，优于对照组的完好率(65％和60％)，表明枯草芽孢杆菌HUB0219对抑制荸荠在贮藏过程中的真菌侵染造成的腐烂具有明显效果。实施例9采用与实施例7相同的方法，切伤接种处理柑橘、芒果和玉米，检测HUB0219对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)的抑制效果。对比例选取市售枯草芽孢杆菌，采用切伤接种法处理荸荠、柑橘、芒果和玉米，检测市售枯草芽孢杆菌对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)的抑制效果。结果如表3所示，与市售枯草芽孢杆菌相比，HUB0219对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)的抑制效果更佳。表3果实品种HUB0219市售枯草芽孢杆菌荸荠75％33％柑橘71％42％芒果66％45％玉米69％26％综上所述，本发明的枯草芽孢杆菌HUB0219对根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)、柑橘青霉(P.italicum)、芒果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)和玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)等多种常见植物病原真菌具有良好的拮抗作用；在抑制荸荠贮藏过程中腐烂的发生具有明显效果，荸荠贮藏30天和60天时，完好率高达97.5％和95％，有望开发成为农用生防菌和生物保鲜剂。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表<110>惠州学院<120>一株荸荠内生枯草芽孢杆菌及其应用<130>20190524<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成()<400>1tacggytaccttgttacgactt22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成()<400>2tacggytaccttgttacgactt22<210>3<211>1396<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌()<400>3gagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgg60gtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgt120ttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgc180ggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctg240agagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300tagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaagg360ttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggta420ccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatac480gtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaa540gtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgag600tgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaa660caccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtgggg720agcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttag780ggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgg840tcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggt900ttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagag960ataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgt1020cgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatt1080cagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtca1140aatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggc1200agcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctg1260caactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaat1320acgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagt1380cggtgaggtaaccttt1396当前第1页1 2 3