本发明涉及生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种防止芽孢杆菌退化的方法。
背景技术：
四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又名川芎嗪，是吡嗪环碳原子上均连接甲基的含氮杂环化合物，具有烘烤香气、甜香，同时其是中药材川芎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等药理作用。现代研究表明，四甲基吡嗪是中国白酒中重要的香气化合物以及健康的风味成分，在酱香、芝麻香等采用高温曲发酵的白酒中普遍存在。
长期以来，人们一直认为中国白酒中的四甲基吡嗪主要是由美拉德反应产生的，江 南大学在通过现代风味化学、微生物学与代谢工程等科学理论和先进技术手段，首次证实了 中国白酒中四甲基吡嗪并非美拉德途径所产生。通过对中国白酒中高产四甲基吡嗪前体乙偶 姻功能菌株的筛选与功能菌株代谢机制的分析，确定了中国白酒中四甲基吡嗪的产生机制 为：功能菌株糖降解产生丙酮酸，两分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脱羧 产生乙偶姻，发酵体系中的乙偶姻和主要由氨基酸转化而来的氨经过非酶促反应生成四甲基 吡嗪。同时，基于四甲基吡嗪产生机制，建立了四甲基吡嗪发酵合成的代谢调控技术，有效 提高了四甲基吡嗪发酵合成能力，最终证实并实现功能菌株在白酒生产中的有效应用。
但是，实践中发现，大多数功能菌在一次发酵时能高效产生四甲基吡嗪，但在传代发酵中，菌株迅速退化，四甲基吡嗪的产量急速降低。现有技术中，通常将已经退化的菌株，采用复壮培养基的形式或添加复壮剂的方法进行复壮，来保持菌株的稳定性能，或是在传代发酵过程中添加某种物质来防止菌种退化。这种方法需要额外添加物质，操作复杂并且成本高，不适合大规模生产。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种防止芽孢杆菌退化的方法，该方法将一次发酵的发酵产物经防退化处理后作为菌种载体，接种至传代发酵的物料中，有效地防止了菌种退化，提高了传代发酵中四甲基吡嗪的产量，同时，该方法操作简单、成本低廉，适用于大规模生产。
本发明采用的技术方案如下：
一种防止芽孢杆菌退化的方法，其特征在于，其包括：发酵完成后，将得到的发酵产物进行热处理，然后以热处理后的发酵产物为菌种载体，接种至下一代发酵物料中进行传代发酵。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，热处理即在水浴温度为40-80℃条件下，处理4-8h；并且热处理在无菌环境下进行。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，热处理后的发酵产物占传代发酵的物料质量的10-20%。
发酵过程中，微生物会产生一些对自身不利的次级代谢产物，这些产物的累积是导致其退化的一个重要因素。芽孢杆菌本身为一种嗜热细菌，一次发酵后，对发酵产物进行热处理，一方面有利于不耐热的有害次级代谢产物的分解，另一方面，杀灭其中的不耐热杂菌，从而保留高性能的菌株，在传代发酵过程中保持高产四甲基吡嗪的性能。
需要说明的是，本方法对产生香气物质的芽孢杆菌均适用。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，发酵之前，还包括制备种子液、制备发酵培养基、接种。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，制备种子液即：将芽孢杆菌接种至无菌的培养基中，36-40℃，140-180r/min条件下培养36-60h。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，所述培养基的成分为：按照1000mL计算，酵母膏3-6g，蛋白胨8-12g，氯化钠5-15g，加水至1000mL，调节pH到6.0-8.0；并在110-123℃下灭菌 10-20min。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法所述发酵培养基由麸皮和稻壳组成，其中麸皮与稻壳的质量比为4-6:1；其中麸皮过40目筛，稻壳过10目筛。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，所述发酵培养基在常压下蒸制20-50min，使其含水量为30-40%，然后在110-123℃下灭菌 20-40min即得。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，接种即将种子液接种至发酵培养基，其中，发酵培养基经冷却至30-40℃，接种量为1 wt%-5wt%。
本发明的一种防止芽孢杆菌退化的方法，发酵温度为30-40℃，时间为5-10天，发酵过程中，对物料进行翻动。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供一种防止芽孢杆菌退化的方法，该方法将一次发酵的发酵产物经热处理后作为菌种载体，接种至传代发酵的物料中进行传代发酵。对一次发酵产物进行热处理，一方面有利于不耐热的有害次级代谢产物的分解，另一方面杀灭其中的不耐热杂菌，从而有效地防止了菌种退化，保留高性能的菌株，在传代发酵过程中保持高产四甲基吡嗪的性能，提高了传代发酵中四甲基吡嗪的产量。同时，该方法操作简单、成本低廉，适用于大规模生产。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
本实施例提供一种芽孢杆菌的传代发酵方法，其包括如下步骤：
（1）种子液的制备
取酵母膏3g，蛋白胨12g，氯化钠10g，用清水定容至1000mL，然后调节pH到6.0，121℃条件下灭菌20min。冷却后，接种芽孢杆菌，140r/min、37℃条件下培养48h，得到种子液。
（2）麸皮发酵培养基制备
取麸皮和稻壳，其中，麸皮过40目筛，稻壳过10目筛。将过筛后的麸皮、稻壳质量比为4:1混合，常压下蒸制40min，使水分含量为40%。装入锥形瓶中，用8层纱布封口，121℃条件下灭菌30min，得到发酵培养基。
（3）接种
将制得的发酵培养基冷却至30℃，将种子液接种至发酵培养基中，并搅拌均匀。其中，种子液的接种量为1wt%。
（4）生产发酵
接种后，在发酵温度为30℃条件下，发酵8天，并且每隔一端时间摇动锥形瓶。发酵完成后，测定四甲基吡嗪的产量。
（5）传代发酵
以上一代发酵物为菌种载体，在无菌的环境下，按20wt%接种到下一代发酵，依次传代发酵至4代，每代在发酵完成后，测定其中四甲基吡嗪的含量。
实施例2
本实施例提供一种防止芽孢杆菌退化的传代发酵方法，其包括如下步骤：
（1）种子液的制备
取酵母膏3g，蛋白胨12g，氯化钠10g，用清水定容至1000mL，然后调节pH到6.0，121℃条件下灭菌20min。冷却后，接种芽孢杆菌，140r/min、36℃条件下培养48h，得到种子液。
（2）麸皮发酵培养基制备
取麸皮和稻壳，其中，麸皮过40目筛，稻壳过10目筛。将过筛后的麸皮、稻壳质量比为4:1混合，常压下蒸制40min，使水分含量为40%。装入锥形瓶中，用8层纱布封口，121℃条件下灭菌30min，得到发酵培养基。
（3）接种
将制得的发酵培养基冷却至30℃，将种子液接种至发酵培养基中，并搅拌均匀。其中，种子液的接种量为1wt%。
（4）生产发酵
接种后，在发酵温度为30℃条件下，发酵8天，并且每隔一端时间摇动锥形瓶。发酵完成后，测定四甲基吡嗪的产量。
（5）传代发酵
取上一代发酵得到的发酵产物，在无菌环境中，40℃水浴条件下处理8h，然后将热处理后的发酵产物作为菌种载体，以接种量为20wt%接种到下一代发酵，依次传代发酵至4代，每代在发酵完成后，测定其中四甲基吡嗪的含量。
实施例3
本实施例提供一种防止芽孢杆菌退化的传代发酵方法，其包括如下步骤：
（1）种子液的制备
取酵母膏5g，蛋白胨8g，氯化钠5g，用清水定容至1000mL，然后调节pH到8.0，123℃条件下灭菌10min。冷却后，接种芽孢杆菌，180r/min、38℃条件下培养36h，得到种子液。
（2）麸皮发酵培养基制备
取麸皮和稻壳，其中，麸皮过40目筛，稻壳过10目筛。将过筛后的麸皮、稻壳质量比为5:1混合，常压下蒸制20min，使水分含量为30%。装入锥形瓶中，用8层纱布封口，123℃条件下灭菌20min，得到发酵培养基。
（3）接种
将制得的发酵培养基冷却至40℃，将种子液接种至发酵培养基中，并搅拌均匀。其中，种子液的接种量为5wt%。
（4）生产发酵
接种后，在发酵温度为37℃条件下，发酵5天，并且每隔一端时间摇动锥形瓶。发酵完成后，测定四甲基吡嗪的产量。
（5）传代发酵
取上一代发酵得到的发酵产物，在无菌环境中，80℃水浴条件下处理4h，然后将热处理后的发酵产物作为菌种载体，以接种量为10wt%接种到下一代发酵，依次传代发酵至4代，每代在发酵完成后，测定其中四甲基吡嗪的含量。
实施例4
本实施例提供一种防止芽孢杆菌退化的传代发酵方法，其包括如下步骤：
（1）种子液的制备
取酵母膏4g，蛋白胨10g，氯化钠8g，用清水定容至1000mL，然后调节pH到7.0，121℃条件下灭菌15min。冷却后，接种芽孢杆菌，160r/min、37℃条件下培养48h，得到种子液。
（2）麸皮发酵培养基制备
取麸皮和稻壳，其中，麸皮过40目筛，稻壳过10目筛。将过筛后的麸皮、稻壳质量比为6:1混合，常压下蒸制30min，使水分含量为35%。装入锥形瓶中，用8层纱布封口，121℃条件下灭菌25min，得到发酵培养基。
（3）接种
将制得的发酵培养基冷却至35℃，将种子液接种至发酵培养基中，并搅拌均匀。其中，种子液的接种量为4wt%。
（4）生产发酵
接种后，在发酵温度为37℃条件下，发酵6天，并且每隔一端时间摇动锥形瓶。发酵完成后，测定四甲基吡嗪的产量。
（5）传代发酵
取上一代发酵得到的发酵产物，在无菌环境中，60℃水浴条件下处理6h，然后将热处理后的发酵产物作为菌种载体，以接种量15wt%接种到下一代发酵，依次传代发酵至4代，每代在发酵完成后，测定其中四甲基吡嗪的含量。
实施例5
本实施例对本发明提供的防止芽孢杆菌退化的方法的效果进行验证，为其实际应用提供依据。具体的，分别按照实施例1-4中提供的方法进行传代发酵，依次发酵至4代，每代在发酵完成后，按照现有技术中的方法，测定其中四甲基吡嗪的含量，测定结果如表1所示。
表1 四甲基吡嗪产量
由表1可得，实施例1中，第2-4代传代发酵中，四甲基吡嗪的产量较第一代发酵的产量明显降低，到第四代时，四甲基吡嗪的产量已经低至0.01mg/g，完全失去工业生产意义。而实施例2-4中，第2-4代传代发酵中，四甲基吡嗪的产量与第一代产量持平，还出现略微上涨趋势。由此可见，本发明提供的防止芽孢杆菌退化的方法能有效防止芽孢杆菌的退化，提高四甲基吡嗪的产量。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。