一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途与流程

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰
技术领域：
，涉及基于crispr/cas9技术的muher2基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术：
：her2又称之为cerbb-2，中文名为人表皮生长因子受体-2。大约有15-20%的乳腺癌患者为her-2阳性，即her-2基因异常扩增，它是这种类型乳腺癌的发病原因之一。有研究证明her-2阳性，表示该患者的癌细胞恶性程度较高，生存期较其他类型短。乳腺癌目前是中国女性发病率第1位的恶性肿瘤，严重威胁着患者的健康。her2阳性乳腺癌约占侵袭性乳腺癌的20%～30%，与肿瘤的高侵袭性、高复发风险、进展快速及不良预后相关。大量针对her2靶点抗体药物、cart、carnk等的研发及临床应用，改变了这部分患者的预后。her2基因是原癌基因，位于人类第17号染色体长臂（17q21-q22），又称erbb2，属于erb家族中的一员，其他成员还包括erbb1（egfr）、erbb3（her3）和erbb4（her4），这个家族在许多正常和异常表皮细胞的生长、分化和转移过程中起着重要的调控作用，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。而her2受体由胞外配体结合域（ecd）、亲脂的跨膜域（tmd）和带有调节羧基末端片段的胞内域（icd）构成。her2至今仍未发现高亲和力配体，必须与家族其他成员组成同源或异源二聚体，受体二聚化后构象发生改变，并与atp结合激活胞内的酪氨酸激酶活性，为多种下游分子提供停泊位点，从而启动下游信号传导通路，继而传导入细胞核，激活核内一系列转录因子，在转录水平调控、合成供细胞生长、增殖、分化所需蛋白质，但许多肿瘤的发生、发展和病情轻重也与her2活性大小密切相关，近几年大量针对her2靶点抗体药物、cart、carnk等的研发及临床应用，使肿瘤患者看到了希望。但复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要小鼠肿瘤细胞模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠肿瘤细胞来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。因此，在不改变小鼠免疫系统的前提下，构建人源化小鼠肿瘤细胞模型具有重要的意义，可以更好的反应预期临床数据。her2免疫检查点抑制剂突破了黑色素瘤的瓶颈，ipilimumab(yervoy)是靶向作用于her2的全人源化单克隆抗体，于2011年被fda批准治疗转移性黑色素瘤。临床前及临床试验结果表明，使用her2抑制剂+pd1抑制剂的联合治疗时，黑色素瘤疗效高达75％(her2抑制剂是30％，pd1是45％)。ipilimumab在肺癌治疗中的临床试验中，与化疗药物紫杉醇/卡铂联合使用，用于nsclc试验，毒副反应可很好的耐受。同时，目前有多个ipilimumab联合其他免疫检查点或小分子化药等的临床正在推进，如ipilimumab与pd-1抑制剂opdivo(nivolumab)已合并用于黑色素瘤治疗。ipilimumab作为肿瘤免疫治疗先驱，开启了免疫治疗的先河。但同时，伴随着严重的临床毒副作用导致了临床试验的紧急叫停，ipilimumab治疗的患者一半以上产生了3-4级严重的副作用，导致皮肤、垂体和肠道毒性反应，限制了抗人her2抗体的研发与应用。尤其在免疫联合治疗的潮流下，ipilimumab与其他靶点药物(如pd-1抗体nivolumab)强强联合是未来的趋势，如何提高抗her2抗体在肿瘤免疫治疗中的效果，并减少其诱发的免疫副作用，成一个亟待解决的课题。利用基因改造技术，将小鼠肿瘤细胞模型muher2基因的胞外区进行人源化，保留胞内区及跨膜区序列，构建人源化小鼠肿瘤细胞，具有可直接进行人hsher2抑制剂的评价、小鼠自身免疫系统不受影响、因小鼠近交系特点实验数据高重复性的特点。利用her2人源化的小鼠肿瘤细胞模型，可以有效的评价抗人her2抗体及cart调动免疫系统对人源化肿瘤细胞的杀伤；模拟临床上ipilimumab单用及联用造成的各个脏器的免疫副作用，可以用于评估抗人her2抗体及cart的安全性。因此，her2人源化小鼠肿瘤细胞模型（4t1-huher2）可以有效地推动抗体药物从体外筛选到临床试验的进程，并为药物临床前试验提供充足有力的数据(抗肿瘤药效分析及验证、免疫治疗与小分子药物、免疫治疗抗体药物与化疗联合用药的药效评价等)。综上所述，建立一种her2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法非常必要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种her2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法；可用于建立抗人her2抗体临床前筛选的her2人源化小鼠肿瘤细胞模型及药效评价平台。本发明的目的还在于提供一种her2基因修饰人源化小鼠肿瘤细胞模型的应用。本发明的第一个方面，提供了：一种her2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，包括如下步骤：第1步，确定her2人源序列以及所述her2人源序列在小鼠细胞模型her2基因中的替换区域；所述小鼠细胞模型her2基因的胞外区替换为所述her2人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgrna；第3步，设计并构建携带所述her2人源序列的人源化载体；第4步，将cas9-sgrna载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型her2基因敲除，获得her2基因敲除的细胞；第5步，构建含有人源化her2基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的her2基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源her2的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源her2基因的胞外区序列。在一个实施方式中，her2人源序列如seqidno.8所示。在一个实施方式中，针对小鼠细胞模型序列的sgrna的序列如seqidno.2或者seqidno.3所示。在一个实施方式中，第3步中人源化打靶载体的构建方法包括：使用bsmbi酶切lenticrisprv2质粒，再将产物与sgrna连接，转化至感受态细胞中。在一个实施方式中，含有人源her2基因的载体的构建方法是：将含有her2人源胞外区、her2鼠源跨膜区和胞内区的序列插入至plvx慢病毒包装载体中，再包装至慢病毒中获得。在一个实施方式中，人源胞外区的序列如seqidno.9所示。本发明的第二个方面，提供了：由上述方法构建得到的her2基因人源化小鼠肿瘤细胞。本发明的第三个方面，提供了：上述的肿瘤细胞在用于制备肿瘤疾病研究的模型中的应用。在一个实施方式中，肿瘤疾病研究的模型是指以人her2为靶点的cart、carnk、抗体药的靶细胞。有益效果本发明方法构建的her2人源化小鼠肿瘤细胞，将小鼠her2基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化小鼠肿瘤细胞模型拥有人源胞外区，可筛选人源免疫检查点药物(如抗体药；cart、carnk等)；而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为(激活或抑制)。her2人源化小鼠不仅可以用于抗体肿瘤药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义。同时也是抗人her2抗体药物安全性评价的理想模型，对her2抗体药物的毒理学进行临床前体内评价。her2人源化小鼠不仅可供于抗人her2抗体单药评价，同时可用于her2抗体联合其他药物(小分子或抗体药)抗肿瘤药效评价，cart、carnk细胞杀伤肿瘤评价，对临床前药效评价有着深远的指导意义。附图说明图1是muher2基因敲除示意图；敲除位点选在atg后第三个外显子上图2是cas9-sgrna载体构建测序比对结果；图3sgrna敲除效率；muher2-sgrna1切除效率为：85.1%muher2-sgrna2切除效率为：71.5%图4plvx-huher2pcr扩增m：dl5000marker1：huher2pcr产物图5plvx-huher2重组质粒测序比对结果；图64t1细胞muher2&huher2表达情况；4t1-huher2cellpool中muher2敲除效率为：80.1%；huher2表达效率为：55.1%图74t1-huher2稳定细胞株muher2&huher2表达情况；a：4t1细胞中muher2表达情况b：4t1细胞中huher2表达情况c、e、g、i、k：4t1-huher2稳定细胞株中muher2表达情况d、f、h、j、l：4t1-huher2稳定细胞株中huher2表达情况具体实施方式1.1muher2sgrna设计1.1.1sgrna寡核苷酸链合成使用crispr在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，分别在her2的3号外显子上设计2个20bp的sgrna。根据这两条标准找到外显子上的核心序列：her2sgrna-1和her2sgrna-2。编码链模板5′端添加caccg，非编码链模板3′端添加aaac……………….c，与bsmbi酶切后形成的粘性末端互补，设计2对crispr寡核苷酸链。1.1.2muher23号外显子序列：如下所示，其中下划线为靶向位置：gacatccaggaagtccagggatacatgctcatcgctcacaaccgagtgaaacacgtcccactgcagaggttgcgcatcgtgagagggactcagctctttgaggacaagtatgccctggctgtgctagacaaccgagaccctttggacaacgtcaccaccgccgccccaggcagaaccccagaagggctgcgggagctgcagcttcgaagtctcacag（seqidno.1）1.1.3muher2sgrna序列设计得到的两条sgrna序列如下：muher2sgrna-1guidesequence:acgatgcgcaacctctgcagtgg（seqidno.2）muher2sgrna-2guidesequence:gctagacaaccgagaccctttgg（seqidno.3）1.1.4her2靶向位点及sgrna寡核苷酸序列设计2对crispr寡核苷酸链分别如下所示：第一对：her2sgrna-1oligo1：5’-caccgacgatgcgcaacctctgcag-3’；（seqidno.4）her2sgrna-1oligo2：5’-aaacctgcagaggttgcgcatcgtc-3’；（seqidno.5）第二对：her2sgrna-2oligo1：5’-caccggctagacaaccgagaccctt-3’；（seqidno.6）her2sgrna-2oligo2：5’-aaacaagggtctcggttgtctagcc-3’；（seqidno.7）1.2cas9-muher2sgrna载体构建合成上述设计得到的sgrna单链，形成双链dna后构建于载体中。具体步骤如下：1.2.1使用bsmbi酶切1μglenticrisprv2质粒，30min，37℃；反应体系如下：1.2.2使用天根胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。1.2.3sgrnaoligo退火及双链的形成反应体系如下：退火程序如下：1.2.4lenticrisprv2&sgrna连接，16℃孵育2h。反应体系如下：1.2.5将连接后的质粒转化至感受态细胞dh5α中，均匀涂至amp抗性lb固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。1.2.6挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。1.2.7测序鉴定质粒构建成功，命名为lenticrisprv2-muher2sgrna-1&lenticrisprv2-muher2sgrna-2。1.2.8结论：测序结果显示成功构建muher2基因敲除载体：lenticrisprv2-muher2sgrna-1lenticrisprv2-muher2sgrna-21.3脂质体法转染v2-muher2sgrna1.3.1预混试剂预混：a&baopti-mem125ullipo3000r3.75ulbopti-mem125ul质粒dna5ugp3000tm10ul1.3.2提前一天用完全培养基（10％胎牛血清的高糖dmem培养基）接种小鼠乳腺癌4t1细胞，于5％co2，37℃恒温培养箱中培养1.3.3细胞达到70-90%汇合度时转染1.3.4使用opti-memlipofectaminer3000试剂充分混匀1.3.5使用opti-mem培养基稀释dna制备dna预混液，然后添加p3000tm试剂充分混匀1.3.6将稀释dna与稀释的lipofectaminer3000试剂混合（1:1）1.3.7孵育5mins1.3.8加入dna-脂质体复合物至细胞中1.3.948-72h用含1ng/ml嘌呤霉素（puro）完全培养基抗性筛选1.3.10待对照细胞完全死亡，改用完全培养基恢复培养2-3天1.3.11消化，收集细胞用于facs法鉴定敲除效率1.4流式检测muher2敲除效率1.4.1收集1.3中cellpool细胞，至15ml离心管中，1000r/min，离心5min后弃液。1.4.2再加入10ml预冷的pbs重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000r/min，离心5min后弃液，再加入10ml预冷的pbs同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用pbs重悬细胞制成1×106/ml的单细胞悬液。（3）用muher2-apc（bd340554）来标记表达经敲除的4t1细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2ulmuher2-apc（bd340554）。（4）避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的pbs清洗2次，离心弃液。（5）最后加入500μlpbs，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。（6）另取一个上样管，加入0.1ml初始细胞悬液，补加0.4mlpbs，作为阴性对照管。（7）用流式细胞仪进行检测，操作如下：a．用分析管中的细胞检测样品中的敲除muher2的4t1细胞的比例。b．用分析管中的细胞检测样品中的敲除muher2的4t1细胞的比例。检测结果如图3所示，切割效率如下所示：sgrna名称切割效率muher2sgrna-185.1%muher2sgrna-271.5%由此可以看出，sgrna1具有更高的切割效率，后续实验将使用sgrna-1进行基因敲除的细胞系。2muher2人源化2.1muher2人源化2.1.1人源胞外区、鼠源跨膜区、鼠源胞内区序列：设计的人源化muher2的序列（seqidno.8）如下所示：其中人源胞外区为下划线所示（seqidno.9），鼠源跨膜区（seqidno.10）如斜体所示，鼠源胞内区（seqidno.11）如黑体所示：atggagctggcggccttgtgccgctgggggctcctcctcgccctcttgccccccggagccgcgagcacccaagtgtgcaccggcacagacatgaagctgcggctccctgccagtcccgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctggctctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaagggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgtgccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcagtgtgctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccacagtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgtttgagtccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccctacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaaccaagaggtgacagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagtgcagcaagccctgtgcccgagtgtgctatggtctgggcatggagcacttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcactgctggggtccagggcccacccagtgtgtcaactgcagccagttccttcggggccaggagtgcgtggaggaatgccgagtactgcaggggctccccagggagtatgtgaatgccaggcactgtttgccgtgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggaggctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaagggctgccccgccgagcagagagccagccctctgacgttcatcattgcaactgtggtgggcgtcctgttgttcctgatcatagtggtggtcattggaatcctaatcaaacgaaggcgacagaagatccggaagtataccatgcgtaggctgctgcaggagaccgagctggtggagccgctgacgcccagtggagctgtgcccaaccaggctcagatgcggatcctaaaggagacagagctaaggaagctgaaggtgcttgggtcaggagccttcggcactgtctacaagggcatctggatcccagatggggagaacgtgaaaatccccgtggccatcaaggtgttgagggaaaacacatctcctaaagctaacaaagaaatcctagatgaagcgtacgtcatggctggtgtgggttctccatatgtgtcccgcctcctgggcatctgcctgacatccacagtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgccttctggaccatgtccgagaacaccgaggtcgcttaggctcccaggacctgctcaactggtgtgttcagattgccaaggggatgagctacctggaggaagttcggcttgttcacagggacctagctgcccgaaacgtgctagtcaagagtcccaaccacgtcaagattaccgacttcgggctggcacggctgctggacattgatgagactgaataccatgcagatgggggcaaggtgcccatcaagtggatggcattggaatctattctcagacgccggttcacccatcagagtgatgtgtggagctatggtgtgactgtgtgggagctgatgacctttggggccaaaccttacgatgggatcccagctcgggagatccctgatttgctggagaagggagaacgcctacctcagcctccaatctgcaccatcgacgtctacatgatcatggtcaaatgttggatgattgactccgaatgtcgcccgagattccgggagttggtatcagaattctcccgtatggcaagggacccccagcgctttgtggtcatccagaacgaggacttaggcccctccagccccatggacagcaccttctaccgttcactgctggaggatgatgacatgggggagctggtcgatgctgaagagtacctggtaccccagcagggattcttctccccagaccctgccctaggtactgggagcacagcccaccgcagacaccgcagctcgtcggccaggagtggcggtggtgagctgacactgggcctggagccctcggaagaagagccccccagatctccactggctccctccgaaggggctggctccgatgtgtttgatggtgacctggcagtgggggtaaccaaaggactgcagagcctctctccacatgacctcagccctctacagcggtacagtgaggatcccacattacctctgccccccgagactgatggctacgttgctcccctggcctgcagcccccagcccgagtatgtgaaccagccagaggttcggcctcagtctcccttgaccccagagggtcctccgcctcccatccgacctgctggtgctactctagaaagacccaagactctctctcctgggaaaaatggggttgtcaaagacgtttttgcctttgggggtgctgtggagaaccctgaatacttagcacccagagcaggcactgcctctcagccccacccttctcctgccttcagcccagcctttgacaacctctattactgggaccagaactcatcggagcagggtcctccaccaagtacctttgaagggacccccactgcagagaaccctgagtacctaggcctggatgtgccagtatga2.1.2huher2全长基因pcr扩增引物：用于扩增huher2基因的pcr引物序列如下所示，直接获得相应的序列，可以通过基因合成的方法获得人源化序列。huher2-fl-xho1-f：cctcgagatggagctggcggccttgt（seqidno.12）huher2-fl-xba1-r：ctctagatcatactggcacatccaggccta（seqidno.13）2.1.3huher2pcr鉴定&测序引物：扩增后，通过如下的引物对产物进行鉴定和测序：huher2-jc-f：cagaatggctcagtgacctgt（seqidno.14）huher2-jc-r：tcttctgtcgccttcgttt（seqidno.15）2.2plvx-huher2构建通过xbai和xho1酶切位点将huher2基因克隆入plvx慢病毒包装载体，经pcr扩增筛选阳性重组质粒如图，分别如图4和图5所示，测序验证正确。反应体系如下：h2o31ulbuffer5ulq5（诺唯赞）1ulprimerf1ulprimerr1ulsample1ultotal50ul反应程序如下：2.3lv-huher2慢病毒制备2.3.1293t细胞接种将生长状态良好的293t细胞用0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液并调整浓度为4x10^5/ml，取10ml接种于10cm培养皿中。37˚c，5%co2培养箱内培养过夜，第二天细胞汇合度将达到80%。2.3.2病毒包装将8.5µgpmd2g、17µgpspax2和plvx-huher2质粒34µg加到3mlopti-mem内混匀，加入120µlx-tremegenehpdnatransfectionreagent混匀，室温静置15min。逐滴加入到培养瓶内，充分混匀。12h后更换为含10%fbs的dmem新鲜培养液。（质粒要求：浓度1µg/µl，纯度od260/od280的值在1.8~2.0范围内）2.3.3收集上清浓缩病毒细胞培养48h后，收集培养基（含慢病毒），1500g，4˚c，离心10min去细胞碎片。然后用0.45µm滤膜过滤病毒上清液。过滤液，25000g，4℃，离心2.5h。弃去上清，用含5%fbs的dmem培养液重悬病毒团块。200µl/管分装，-80˚c保存，待用。3病毒感染&检测3.1lv-huher2感染muher2敲除的4t1细胞muher2敲除的4t1细胞的生长情况可以用倒置显微镜观察，当细胞生长状态良好，密度为70%左右时可进行感染（约10e6）。按照moi=5:1准确计算好需要加lv-huher2的量（病毒滴度10e8，约50ul），直接将病毒悬液加入到6孔板上的t细胞培养基中，同时以未感染细胞为空白对照。感染后将6孔板放入细胞培养箱中过夜培养，约16-18h后换液。3.2流式细胞仪检测4t1细胞表面huher2&muher2的表达3.2.1慢病毒感染muher2基因敲除的4t1细胞5d后，收集4t1细胞至15ml离心管中，1000r/min，离心5min后弃液。3.2.2再加入10ml预冷的pbs重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000r/min，离心5min后弃液，再加入10ml预冷的pbs同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用pbs重悬细胞制成1×106/ml的单细胞悬液。3.2.3分别用hsher2-pe（biolegend324412）muher2-apc（bd340554）来标记表达huher2的4t1细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2ulhsher2-pe（biolegend324412）/muher2-apc（bd340554）。3.2.4避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的pbs清洗2次，离心弃液。3.2.5最后加入500μlpbs，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。3.2.6另取一个上样管，加入0.1ml初始细胞悬液，补加0.4mlpbs，作为阴性对照管。3.2.7用流式细胞仪进行检测，操作如下：a．用阴性对照管中的细胞调节阴性对照。b．用分析管中的细胞检测样品中的表达muher2的4t1细胞的比例。c．用分析管中的细胞检测样品中的表达hsher2的4t1细胞的比例。图64t1细胞muher2&huher2表达情况；4t1-huher2cellpool中muher2敲除效率为：80.1%；huher2表达效率为：55.1%。4有限稀释法挑选muher2敲除&huher2稳定表达细胞系4.1病毒感染muher2基因敲除的4t1细胞5d后，收集4t1细胞至15ml离心管中，1000r/min，离心5min后弃废液。4.2从ep管中取10ul细胞悬液，加入10ul台盼蓝染液，混匀，计数。4.3通过计数结果计算需要铺板的细胞数，平均使每个孔里面的细胞个数为0.5-1个，如通过计算，从ep管中取出180个细胞加入到适量的培养基中，混匀后，均匀的铺入2块96孔板中，每孔150ul，即将这180个细胞均匀的铺入到2块96孔板中，理论上每个孔的细胞数为0.92个。4.4铺完板后可在显微镜下观察一下，若发现有些孔中的细胞大于1个，则可直接放弃该孔，然后放入二氧化碳培养箱中培养，后期观察。54t1-huher2稳定细胞系流式检测（huher2插入&muher2敲除）5.1慢病毒感染muher2基因敲除的4t1细胞5d后，收集4t1细胞至15ml离心管中，1000r/min，离心5min后弃液。5.2再加入10ml预冷的pbs重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000r/min，离心5min后弃液，再加入10ml预冷的pbs同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用pbs重悬细胞制成1×106/ml的单细胞悬液。5.3分别用hsher2-apc（biolegend324412）/muher2-apc（bd340554）来标记表达huher2的4t1细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2ulhsher2-apc/muher2-apc（bd340554）。5.4避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的pbs清洗2次，离心弃液。5.5最后加入500μlpbs，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。5.6另取一个上样管，加入0.1ml初始细胞悬液，补加0.4mlpbs，作为阴性对照管。5.7用流式细胞仪进行检测，操作如下：a．用阴性对照管中的细胞调节阴性对照。b．用分析管中的4t1稳定细胞系是否表达muher2。c．用分析管中的4t1稳定细胞系是否表达hsher2。5.8结果分析发现，4t1肿瘤细胞中未检测到huher2表达，但可以检测到muher2表达，而4t1-huher2单克隆稳定细胞系中仅能检测到huher2表达，未能检测到muher2表达，表明本方法成功制备了4t1-huher2人源化小鼠肿瘤细胞，可作为人her2靶点cart、carnk、抗体药的靶细胞，可为cart、carnk、抗体药小鼠体内评价提供肿瘤细胞。序列表<110>江苏浦珠生物医药科技有限公司<120>一种her2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途<130>无<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>217<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gacatccaggaagtccagggatacatgctcatcgctcacaaccgagtgaaacacgtccca60ctgcagaggttgcgcatcgtgagagggactcagctctttgaggacaagtatgccctggct120gtgctagacaaccgagaccctttggacaacgtcaccaccgccgccccaggcagaacccca180gaagggctgcgggagctgcagcttcgaagtctcacag217<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acgatgcgcaacctctgcagtgg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gctagacaaccgagaccctttgg23<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4caccgacgatgcgcaacctctgcag25<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaacctgcagaggttgcgcatcgtc25<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6caccggctagacaaccgagaccctt25<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aaacaagggtctcggttgtctagcc25<210>8<211>3768<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8atggagctggcggccttgtgccgctgggggctcctcctcgccctcttgccccccggagcc60gcgagcacccaagtgtgcaccggcacagacatgaagctgcggctccctgccagtcccgag120acccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctg180gaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtg240cagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcgg300attgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatgga360gacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctg420cagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccag480ctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctggct540ctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaag600ggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgt660gccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcagtgt720gctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccac780agtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgtttgag840tccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccc900tacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaaccaa960gaggtgacagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagtgcagcaagccctgtgcccga1020gtgtgctatggtctgggcatggagcacttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaat1080atccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagc1140tttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgttt1200gagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcct1260gacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcc1320tactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaa1380ctgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtg1440ccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggcca1500gaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcactgc1560tggggtccagggcccacccagtgtgtcaactgcagccagttccttcggggccaggagtgc1620gtggaggaatgccgagtactgcaggggctccccagggagtatgtgaatgccaggcactgt1680ttgccgtgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggag1740gctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgc1800cccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggag1860ggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaag1920ggctgccccgccgagcagagagccagccctctgacgttcatcattgcaactgtggtgggc1980gtcctgttgttcctgatcatagtggtggtcattggaatcctaatcaaacgaaggcgacag2040aagatccggaagtataccatgcgtaggctgctgcaggagaccgagctggtggagccgctg2100acgcccagtggagctgtgcccaaccaggctcagatgcggatcctaaaggagacagagcta2160aggaagctgaaggtgcttgggtcaggagccttcggcactgtctacaagggcatctggatc2220ccagatggggagaacgtgaaaatccccgtggccatcaaggtgttgagggaaaacacatct2280cctaaagctaacaaagaaatcctagatgaagcgtacgtcatggctggtgtgggttctcca2340tatgtgtcccgcctcctgggcatctgcctgacatccacagtgcagctggtgacacagctt2400atgccctatggctgccttctggaccatgtccgagaacaccgaggtcgcttaggctcccag2460gacctgctcaactggtgtgttcagattgccaaggggatgagctacctggaggaagttcgg2520cttgttcacagggacctagctgcccgaaacgtgctagtcaagagtcccaaccacgtcaag2580attaccgacttcgggctggcacggctgctggacattgatgagactgaataccatgcagat2640gggggcaaggtgcccatcaagtggatggcattggaatctattctcagacgccggttcacc2700catcagagtgatgtgtggagctatggtgtgactgtgtgggagctgatgacctttggggcc2760aaaccttacgatgggatcccagctcgggagatccctgatttgctggagaagggagaacgc2820ctacctcagcctccaatctgcaccatcgacgtctacatgatcatggtcaaatgttggatg2880attgactccgaatgtcgcccgagattccgggagttggtatcagaattctcccgtatggca2940agggacccccagcgctttgtggtcatccagaacgaggacttaggcccctccagccccatg3000gacagcaccttctaccgttcactgctggaggatgatgacatgggggagctggtcgatgct3060gaagagtacctggtaccccagcagggattcttctccccagaccctgccctaggtactggg3120agcacagcccaccgcagacaccgcagctcgtcggccaggagtggcggtggtgagctgaca3180ctgggcctggagccctcggaagaagagccccccagatctccactggctccctccgaaggg3240gctggctccgatgtgtttgatggtgacctggcagtgggggtaaccaaaggactgcagagc3300ctctctccacatgacctcagccctctacagcggtacagtgaggatcccacattacctctg3360ccccccgagactgatggctacgttgctcccctggcctgcagcccccagcccgagtatgtg3420aaccagccagaggttcggcctcagtctcccttgaccccagagggtcctccgcctcccatc3480cgacctgctggtgctactctagaaagacccaagactctctctcctgggaaaaatggggtt3540gtcaaagacgtttttgcctttgggggtgctgtggagaaccctgaatacttagcacccaga3600gcaggcactgcctctcagccccacccttctcctgccttcagcccagcctttgacaacctc3660tattactgggaccagaactcatcggagcagggtcctccaccaagtacctttgaagggacc3720cccactgcagagaaccctgagtacctaggcctggatgtgccagtatga3768<210>9<211>1956<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9atggagctggcggccttgtgccgctgggggctcctcctcgccctcttgccccccggagcc60gcgagcacccaagtgtgcaccggcacagacatgaagctgcggctccctgccagtcccgag120acccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctg180gaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtg240cagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcgg300attgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatgga360gacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctg420cagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccag480ctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctggct540ctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaag600ggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgt660gccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcagtgt720gctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccac780agtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgtttgag840tccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccc900tacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaaccaa960gaggtgacagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagtgcagcaagccctgtgcccga1020gtgtgctatggtctgggcatggagcacttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaat1080atccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagc1140tttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgttt1200gagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcct1260gacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcc1320tactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaa1380ctgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtg1440ccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggcca1500gaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcactgc1560tggggtccagggcccacccagtgtgtcaactgcagccagttccttcggggccaggagtgc1620gtggaggaatgccgagtactgcaggggctccccagggagtatgtgaatgccaggcactgt1680ttgccgtgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggag1740gctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgc1800cccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggag1860ggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaag1920ggctgccccgccgagcagagagccagccctctg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