一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用。

背景技术：

在植物分子生物学及功能基因研究中，基因过表达和亚细胞定位技术应用广泛。通常，基因过表达研究需要在植物过表达空载体上插入目的基因序列构建重组的过表达质粒载体；亚细胞定位研究则需要在亚细胞定位空载体上插入目的基因序列构建重组的亚细胞定位质粒载体；过表达和亚细胞定位研究需要分别构建相应载体，费时费力费钱。

多功能载体的使用将大大减小载体构建的工作量，省事省力省钱，在植物亚细胞定位研究中，通常将目的基因与绿色荧光蛋白(gfp)基因进行融合表达，来实现目的基因翻译的蛋白的定位。而实际应用中往往存在因为所用载体上gfp表达量偏低而导致亮度不够的原因而影响实验结果，急需一种能高效表达gfp融合蛋白的亚细胞定位载体。

植物转基因一般需要将转化细胞或组织经过一段时间的组织培养再生的过程才能形成转基因植株。这个过程短则两三个月，长则十几个月甚至一年。植物转基因整个过程涉及到许多组培样品和再生植株样品的分子检测，来检测样品是否为转基因阳性。目前一般采用设计特异性引物对样品基因组dna进行pcr扩增检测目的条带的方法来进行转基因样品的阳性检测，这种检测方法需要大批量地提取基因组dna、消耗大量pcr酶、并需要大量地制备琼脂糖凝胶及电泳操作，整个检测过程极其耗费人力物力和时间。急需一种更为快速简便的检测方法。

技术实现要素：

针对上述现有的在植物亚细胞定位研究中，载体上gfp表达量偏低，植物转基因中对转基因样品进行检测时存在耗时长，耗费大量人力和物力的缺陷，本发明的目的是提供一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用，仅需一次构建，得到的重组质粒载体和转基因植株可同时用于过表达研究和亚细胞定位研究，同时得到的转基因植株或组织样品可非常方便快速地进行阳性检测。

本发明采用的技术方案如下：

一种多功能植物表达载体，所述多功能植物表达载体为pesnoo-eygfpur-apply，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本申请的技术方案中，由于目的基因上下游调控元件的添加，相较于普通的以camv35spromoter启动子驱动的过表达载体而言，目的基因的表达会显著增强，同时由于目的基因和eygfpuv融合表达，eygfpuv的表达也显著增强；在进行亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，转化该载体的细胞中目的基因和eygfpuv融合蛋白亮度更高，更便于观察定位结果；用此载体进行植物遗传转化，得到的转基因组织和植株会表达大量的目的基因和eygfp融合蛋白，在进行阳性检测时，无需进行基因组dna提取和pcr扩增，仅需用uv手电筒照射组织样品(如棉花、水稻等的愈伤组织)或植株样品(再生苗或者拟南芥t0代种子或t1代叶片)，通过观察激发出来的绿色荧光的有无即可判断是否为阳性，极大地较少了转基因样品分子检测的工作量。

一种多功能植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)将植物中通用组成型表达启动子camv35spromoter(enhanced)、高效调控翻译的顺式作用元件cor47-5′utr、紫外线uv可激发的eygfpuv基因、高效调控表达的hspt878终止子构建置于pcambia2300植物表达载体的t-dna区右边界上游；

(2)在cor47-5′utr后插入了多克隆位点序列；

(3)将目的基因cds序列无缝构建到eygfpuv基因上游；

(4)在eygfpuv基因上游添加了6xgly序列，来连接和间隔目的基因cds序列和eygfpuv基因。

优选的，步骤(1)中，紫外线uv可激发的eygfpuv基因的最大激发波长为398nm，最大发射波波长为512nm。

更为优选的，步骤(3)中的目的基因cds序列是通过酶切酶连或同源重组的方法构建到载体上的多克隆点位置并与eygfpuv基因融合表达。

更为优选的，步骤(3)中，酶切是利用kpni和sbfi两个酶对载体进行双酶切，得到线性化载体用于目的基因通过同源重组的方法来实现无缝克隆。

一种多功能植物表达载体在受体植物转化、亚细胞定位或bifc(双分子荧光互补)中的应用。

该载体的大小为10714bp，具有卡那抗性标记基因，在t-dna区外的卡那抗性标记基因可赋予转化该载体的菌体以卡那抗性，t-dna区内的卡那抗性标记基因可赋予转基因组织或植株以卡那抗性。

本申请的技术方案中对载体进行了适当的精简，以使载体大小更小，更利于其转化到大肠杆菌和农杆菌体内。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、基因过表达效果更明显：由于目的基因上下游调控元件的添加，相较于普通的以camv35spromoter启动子驱动的过表达载体而言，目的基因的表达会显著增强；

2、亚细胞定位亮度更高，更容易观察：由于目的基因和eygfp融合表达，eygfp的表达也显著增强。在进行亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，转化该载体的细胞中目的基因和eygfp融合蛋白亮度更高，更便于观察定位结果；

3、转基因组织和植株阳性检测更方便快捷：用此载体进行植物遗传转化，得到的转基因组织和植株会表达大量的目的基因和eygfp融合蛋白，在进行阳性检测时，无需进行基因组dna提取和pcr扩增。仅需用uv手电筒照射组织样品(如棉花、水稻等的愈伤组织)或植株样品(再生苗或者拟南芥t0代种子或t1代叶片)，通过观察激发出来的绿色荧光的有无即可判断是否为阳性；

4、可以通过荧光亮度来粗略判断表达量高低，极大地较少了转基因样品分子检测的工作量；

5、使用uv进行转基因及表达检测，免除基因组dna提取和pcr检测的繁杂工作。

附图说明

图1为本发明载体的结构示意图；

图2为本发明图1中lb到rb的放大图；

图3为转化本发明的载体后，外源基因表达量qpcr定量结果；

图4为本发明中uv手电筒照射后棉花阳性愈伤组织的图；

图5为本发明自然亮度环境中用uv手电筒照射后棉花阳性愈伤组织的图；

图6为转普通gfp载体的烟草叶片和转本发明载体烟草叶片在普通uv手电筒照射后的图；

图7为瞬时转化本发明载体的烟草在普通uv手电筒照射下的发光。

图8为本发明的载体在烟草叶片中进行亚细胞定位结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种多功能植物表达载体，所述多功能植物表达载体为pesnoo-eygfpur-apply，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

实施例2

一种多功能植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)将植物中通用组成型表达启动子camv35spromoter(enhanced)、高效调控翻译的顺式作用元件cor47-5′utr、紫外线uv可激发的eygfpuv基因、高效调控表达的hspt878终止子构建置于pcambia2300植物表达载体的t-dna区右边界上游附近，紫外线uv可激发的eygfpuv基因的最大激发波长为398nm，最大发射波波长为512nm；

(2)在cor47-5′utr后插入了多克隆位点序列；

(3)将目的基因cds序列无缝构建到eygfpuv基因上游，目的基因cds序列是通过酶切酶连或同源重组的方法构建到载体上的多克隆点位置并与eygfpuv基因融合表达，酶切是利用kpni和sbfi两个酶对载体进行双酶切，得到线性化载体用于目的基因通过同源重组的方法来实现无缝克隆；

(4)在eygfpuv基因上游添加了6xgly序列，来连接和间隔目的基因cds序列和eygfpuv基因。

试验例1

qpcr检测：参照图3，图3中pvalue＝0.000146144650621127，***表示差异极显著，由图3知，转化本申请载体后，外源基因的表达量经qpcr检测，表达量大幅度提高。

图3中wt是wildtype，棉花野生型；relativeexpression指相对表达量。

试验例2

转基因阳性检测：参照图4-7，棉花的组织培养，通过手电筒照射，发亮(图中箭头所指)的即为愈伤组织块为阳性，挑取发光的阳性组织块可直接进行继代培养，缩短了检测时间，节省人力物力；由图6知，转本申请载体的叶片发光明显更亮，可以粗略估计其表达量更高；由图7知，瞬时转化本申请载体的烟草在普通uv手电筒照射下的发光，其中图4是在黑箱环境中照射。

试验例3

亚细胞定位：由图8知，说明本发明的载体可以具有亚细胞定位功能，应用于亚细胞定位时，发光强度高，效果好，易观察。

上述试验例各图中，箭头所指为发光的部位。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

如下为seqidno.1序列的序列表。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用

<130>aj2058059

<141>2020-01-17

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10714

<212>dna

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>1

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