一种同时检测CYP2C9和VKORC1基因的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种用于检测cyp2c9基因a1075c位点和vkorc1基因-1639g>a位点的试剂盒及其应用。
背景技术：
：cyp2c9是细胞色素p450酶(cyp)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体p450蛋白总量的20％。cyp2c9参与体内多种药物的羟化代谢。cyp2c9基因具有遗传多态性，人类最常见的等位基因有3种，即野生型cyp2c9*1及突变型cypc2c9*2(rs1799853，c430t，arg144cys)和cyp2c9*3(rs1057910，a1075c，ile359leu)，2种突变型等位基因均可导致cyp2c9酶活性降低，其中cyp2c9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带cyp2c9*1或arg144/ile359等位基因)的4～6％。cyp2c9*2等位基因在亚洲和中国汉族人群中罕见。cyp2c9*3等位基因在中国人群中的频率约为3％。cyp2c9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异现象。华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件。华法林由s-和r-两种消旋体构成，其中s-华法林的抗凝活性约为r-华法林的5倍。85％以上的s-华法林在体内经cyp2c9代谢为无活性的代谢产物，cyp2c9*3纯合子和杂合子基因型个体s-华法林的口服清除率分别下降90％和66％，因此华法林的给药剂量需相应降低。美国fda推荐在使用华法林前进行cyp2c9基因检测。测定cyp2c9*3等位基因可用于指导中国人群确定华法林的起始用药剂量，并预测药物毒性，结合国际标准化比值(internationalnormalizedratio，inr)检测值，估计华法林的维持剂量，确保用药安全。维生素k环氧化物还原酶是华法林抗凝作用的靶点，它是维生素k依赖性凝血因子生成过程中的限速酶，其阻碍维生素k由环氧化物形式转化成氢醌形式，从而阻断凝血因子的活化从而产生抗凝作用。维生素k环氧化物还原酶复合物1的编码基因vkorc1(vitaminkepoxidereductasecomplexsubunit1)启动子区(-1639g>a)的单核苷酸突变-1639g>a可影响vkorc1的表达，从而影响华法林的敏感性，是导致华法林用药剂量个体差异的主要原因之一。与该位点aa基因型患者相比，-1639ga和gg基因型患者平均华法林剂量分别增加52％(95％ci：41～64％)和102％(95％ci：85～118％)。vkorc1多态性对华法林剂量影响的比重因种族而异，-1639ga和gg基因型对白种人华法林剂量的影响比对亚洲人的影响分别高10％和50％。总体上，vkorc1多态性在不同种族不同人群中可解释约27％华法林用药剂量的个体差异。vkorc1-1639a等位基因在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为91.17％、38.79％和10.81％，其频率分布的种族差异与华法林用药剂量差异间具有很好的相关性。目前用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的方法包括pcr-sanger测序法、pcr-焦磷酸测序法、等位基因特异性pcr法、荧光pcr法、pcr-高分辨率熔解曲线法、pcr-基因芯片法、pcr-限制性片段长度多态性方法等。pcr-sanger测序法先进行pcr扩增，获得跨越靶位点的pcr产物，然后纯化pcr产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。它是基因多态性位点检测的金标准。但对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢。等位基因特异性pcr法的反应体系里含两条等位基因特异的引物和一条公用引物，两条等位基因特异的引物只在3'端最后一个碱基存在差异，其他部分碱基序列完全一样。引物3'端的差异(特异)碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的对应碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3',5'-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系(amplificationrefractorymutationsystem,arms)。其扩增结果为：“野生”模板阻碍,“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍,“野生”引物放大。arms-pcr点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶dna错配时可能发生的错配延伸。pcr-限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)法是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列的dna并对其进行剪切的原理。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化就可以导致酶切活性的消失。利用这一特性，若待分型的snp位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种等位基因具有酶切活性。vkorc1基因-1639g>a位点可直接采用pcr-rflp法进行检测，因为其多态位点相关序列为ccrg(r＝g/a)，可由mspi(识别序列ccgg)加以甄别，但现有方法由于缺乏酶切内对照序列，当酶切不完全时，gg型样品易被当作ga型样品对待；当酶未发挥作用时，gg、ga型样品易被当作aa型样品对待，极易出现假阳性，因此该位点基于pcr-rflp法的分型方法有待改进。此外，现有技术使用pcr-rflp法检测cyp2c9基因a1075c、vkorc1基因-1639g>a这2个位点时，通常使用基因组dna作为模板，每个样品需要建立2个pcr反应体系分别进行cyp2c9基因a1075c位点及vkorc1基因-1639g>a的pcr，2个位点相应的pcr产物要分别建立2个酶切反应体系各自进行酶切，酶切后每个样品的2种酶切产物(相应于2个位点)要分别在2个电泳体系进行电泳，因为cyp2c9基因a1075c位点的酶切产物通常需要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳或高浓度琼脂糖凝胶电泳进行检测，vkorc1基因-1639g>a位点的酶切产物采用常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可。仅从内切酶的使用来讲，有使用nsii、mspi这2种酶的，也有使用kpni、mspi这2种酶的，无论哪种组合，都涉及到2种酶，因此也必然会涉及2个pcr反应体系、2个酶切反应体系，操作相对繁琐。技术实现要素：本发明目的在于改进现有pcr-rflp法检测同一样品的cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点无法在同一反应体系进行pcr和酶切的缺点，同时改进现有单独针对每个位点的rflp法容易造成假阳性、假阴性或者电泳繁琐的缺点，同时检测cyp2c9基因a1075c位点和vkorc1基因-1639g>a位点的多态性，并作为血液抗凝治疗者服用华法林的初始剂量和维持剂量的参考。结合inr检测值调整维持剂量，可显著降低华法林用药的副反应和风险。本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供：一种同时检测双位点基因的检测试剂盒，包括cyp2c9基因a1075c位点和vkorc1基因-1639g>a位点的扩增引物组、限制酶和pcr试剂；其中，cyp2c9基因a1075c位点和vkorc1基因-1639g>a位点的扩增引物序列为：cyp2c9基因a1075c位点外侧引物对：f1：gtgttattattgataagtaaggacttaccca(seqidno.1)；r1：tagcaaagttgacagattaacatcatcaga(seqidno.2)；cyp2c9基因a1075c位点内侧引物对：f2：cttcctgtcttcctttattgaagagaattttctccact(seqidno.3)；r2：gtaaatgaattttctgtagtaggtggggagaaggtcca(seqidno.4)；vkorc1基因-1639g>a位点外侧引物对：f3：cacactctctagaagagagtagatgtgag(seqidno.5)；r3：gggccagatgaggtctctcc(seqidno.6)；vkorc1基因-1639g>a位点内侧引物对：f4：ctctctagaagagagtagatgtgagaaacagcatctgga(seqidno.7)；r4：gtcttaaactcctgacctcaagtgatccacccacctgg(seqidno.8)；限制酶为限制性核酸内切酶mvai或其同裂酶。在一些实例中，上述双位点检测试剂盒检测方法包括以下步骤：1)采集样品；2)使用外、内引物对进行pcr扩增；3)对pcr产物进行酶切；4)根据酶切产物电泳条带，确定多态性位点基因型。当然，也可以根据实际需要，合理选择替换上述步骤以达到相似的效果。在一些实例中，步骤4)中确定多态性位点基因型的方法具体为：鉴定完全酶切后的特征性电泳条带；其中，cyp2c9基因a1075c位点的特征性电泳条带为142.5bp和105bp条带；vkorc1基因-1639g>a位点的特征性电泳条带为216.5bp和171.5bp条带。在所选位点中，其他条带因为条带太小，容易跑出凝胶或显色很弱而不能作为特征条带使用。在一些实例中，步骤1)中样品选自细胞样品和dna样品。在一些实例中，上述细胞样品选自口腔上皮细胞、血液细胞、尿道上皮细胞和肠道上皮细胞。当然，也可以根据实际需要，选择其他可替代性细胞。在一些实例中，步骤2)中pcr扩增条件为：94℃、4～8min预变性；94℃、30s变性，52～58℃、30s退火，72℃、15～40s延伸，30～35个循环；72℃、5min末次延伸。当然，也可以根据实际需要，合理调整pcr扩增条件。当然，此处也可以采用其他可替代性技术手段对引物对进行扩增。在一些实例中，步骤4)中酶切产物电泳选用2～3％的琼脂糖凝胶电泳和5～12％的聚丙酰胺凝胶电泳。当然，也可以根据实际需要，选择其他方式识别特征条带。本发明的第二个方面，提供：上述的双位点检测试剂盒在制备指导华法林用药试剂盒中的应用。本发明的第三个方面，提供：一种指导华法林用药的系统，包括样品采集装置和检测分析装置，其中，检测分析装置包括上述的双位点检测试剂盒。本发明的第四个方面，提供：上述的指导华法林用药系统在inr联合检测指导血液抗凝患者用药中的应用。本发明的有益效果是：(1)本发明不需要任何探针，也不需要特别的仪器设备，实验过程简单，可操作性强；(2)本发明中的检测试剂盒可直接以口腔上皮细胞作为初始模板，无需进行基因组dna提取，在同一pcr反应体系实现2个位点的扩增，且在同一酶切反应体系中仅使用同一种限制性核酸内切酶鉴定2个位点，节约成本，提高检测效率；(3)本发明设置了酶切内对照序列，能够在复杂的酶切图谱中通过各个位点相应的2条特征条带的情形来分辨基因型，保证了检测的准确性，且能够通过酶切产物的电泳图谱直观判断酶切效果和分辨其位点基因型，结果直观，适用人群广。附图说明图1为cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点双重pcr扩增之pcr产物电泳图；图2为15个不同样品cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点之双重pcr产物经mvai酶切之后的电泳图谱；图3为cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点6个不同组合基因型样品之双重pcr产物及相应的单重pcr产物经mvai酶切之后的电泳图谱；图4为6个不同样品(a、b、c、d、e、f)cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点的巢式pcr产物的测序结果。具体实施方式为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。本发明具体实施方式分两个阶段进行，第一阶段对随机样本进行基因分型，第二段将第一阶段获得的6种组合基因型的样本集中实验并通过基因测序加以验证。阶段一、基因分型1.制备模板用清水漱口，将消毒棉签伸进口腔壁，紧靠脸颊内侧变换角度擦拭30～40次，用1mlte将细胞涮洗下来，4000rpm离心5min，弃上清，沉淀用50μlte重悬，即可作为模板。2.pcr扩增及鉴定(1)第1轮pcr体系：第1轮pcr扩增条件：94℃、8min预变性；94℃、30s变性，52℃、30s退火，72℃、40s延伸，35个循环；72℃、5min末次延伸；4℃保存。(2)第2轮pcr体系：试剂用量ddh2o18μl2×easytaqsupermix25μl第1轮pcr扩增产物1μl引物f2(10pmol/μl)2μl引物r2(10pmol/μl)2μl引物f4(10pmol/μl)1μl引物r4(10pmol/μl)1μl第2轮pcr扩增条件：94℃、4min预变性；94℃、30s变性，58℃、30s退火，72℃、15s延伸，30个循环；72℃、5min末次延伸；4℃保存。(3)鉴定所有pcr产物均采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳予以鉴定。在进行多样本实验时，上述第1轮pcr、第2轮pcr除了模板外，其他组分可以事先按比例预混在一起，再进行分装，以提高工作效率。此外，上述pcr反应体系、扩增程序可以根据实际情况酌情予以调整。(4)酶切分型酶切体系如下：酶切在37℃水浴锅中进行，时间为10min。对所得酶切产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，120v恒定电压下电泳60分钟，观察电泳图谱以确定基因型。3.结果分析本方案中的引物f2、r2针对a1075c位点；引物f4、r4针对-1639g>a位点，相应的pcr产物理论大小分别为406bp、252bp。图1为15个样品的pcr结果，15个样品在第2轮pcr中均获得了预期大小的目的条带。对于cyp2c9基因a1075c位点，3种基因型样品的巢式pcr产物(406bp)经过mvai完全酶切后的条带分布情况如下：根据条带结果发现，142.5bp和105bp条带可以作为区分cyp2c9基因a1075c位点野生型纯合子aa、杂合子ac以及突变型纯合子cc的特征条带(图2)。对于vkorc1基因-1639g>a位点，3种基因型样品的巢式pcr产物(252bp)经过mvai完全酶切后的条带分布情况如下：vkorc1基因-1639g>a位点216.5bp条带171.5bp条带45bp条带35.5bp条带野生型纯合子gg+－－+杂合子ga++++突变型纯合子aa－+++根据条带结果发现，216.5bp和171.5bp条带可以作为区分vkorc1基因-1639g>a位点野生型纯合子gg、杂合子ga以及突变型纯合子aa的特征条带(图2)。观察分析15个不同样品cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点之双重pcr产物经mvai酶切之后的电泳图谱后，发现其可以清晰地显示出15个不同样品的a1075c位点/-1639g>a位点的基因型，依次为aa/aa、ac/aa、aa/aa、aa/aa、aa/aa、aa/ga、aa/aa、aa/aa、aa/aa、aa/ga、aa/aa、aa/aa、aa/aa、aa/ga、aa/ga。阶段二、基因检测在第一阶段的基础上，把实验室鉴定得到的6种不同组合基因型的样品进行双位点联合分型及每个单位点的独立分型，观察两者的结果是否吻合，具体方案如下：1.模板制备同第一阶段。2.pcr扩增及鉴定(1)第1轮pcr体系和条件同第一阶段。(2)第2轮pcr体系双位点pcr扩增：试剂用量ddh2o9μl2×easytaqsupermix12.5μl第1轮pcr扩增产物0.5μl引物f2(10pmol/μl)1μl引物r2(10pmol/μl)1μl引物f4(10pmol/μl)0.5μl引物r4(10pmol/μl)0.5μl单位点pcr扩增：对于cyp2c9基因a1075c位点：对于vkorc1基因-1639g>a位点：试剂用量ddh2o11μl2×easytaqsupermix12.5μl第1轮pcr扩增产物0.5μl引物f4(10pmol/μl)0.5μl引物r4(10pmol/μl)0.5μl第2轮pcr扩增条件同第一阶段。(4)酶切分型操作同第一阶段，酶切体系中，双位点pcr产物酶切用酶1.5μl，单位点pcr产物酶切用酶1μl，余量用水补足。第2轮pcr扩增产物为双位点第2轮pcr产物或单位点第2轮pcr产物。3.结果分析图3为本实施例中cyp2c9基因a1075c位点、vkorc1基因-1639g>a位点6个不同组合基因型样品的双重pcr产物及相应的单重pcr产物经mvai酶切之后的电泳图谱。图的上半部分为双位点酶切产物电泳图谱。m为dna分子量标记(400、350、300、250、200、150、100bp)；p1为双重pcr产物，2条目标带分别为406bp、252bp，与预期大小相符；a1、b1、c1、d1、e1、f1为6个不同样品a1075c位点和-1639g>a位点的双位点pcr产物酶切图谱，可通过2个位点的特征条带清晰地判断各样品的基因型，依次为a1075c位点/-1639g>a位点＝aa/aa、aa/ga、aa/gg、ac/aa、ac/ga、ac/gg。图的下半部分中m为dna分子量标记(400、350、300、250、200、150、100bp)；p2为a1075c位点pcr产物，目标带为406bp，与预期大小相符；a2、b2、c2、d2、e2、f2为与前述a1、b1、c1、d1、e1、f1一一对应的a1075c位点pcr产物酶切图谱，其基因型依次为aa、aa、aa、ac、ac、ac；p3为-1639g>a位点pcr产物，目标带为252bp，与预期大小相符；a3、b3、c3、d3、e3、f3为与前述a1、b1、c1、d1、e1、f1一一对应的-1639g>a位点pcr产物酶切图谱，其基因型依次为aa、ga、gg、aa、ga、gg。从图中各样品的特征条带的比较中，可以看出，双位点的基因分型结果与单位点的基因分型结果完全吻合，说明了本方法的准确性。此外，方法的准确性还得到了测序验证(图4)，该图显示了a、b、c、d、e、f6个不同样品cyp2c9基因a1075c位点和vkorc1基因-1639g>a位点的pcr产物的测序结果。a-①为cyp2c9基因a1075c位点相应的酶切内对照序列ccagg；a-②的箭头所指碱基为cyp2c9基因a1075c位点的多态位点碱基，为野生纯合子aa；a-③的箭头所指碱基为vkorc1基因-1639g>a位点的多态位点碱基，为突变型纯合子aa；a-④为vkorc1基因-1639g>a位点相应的酶切内对照序列ccagg，其a1075c位点/-1639g>a位点基因型＝aa/aa。b-①为cyp2c9基因a1075c位点相应的酶切内对照序列ccagg；b-②的箭头所指碱基为cyp2c9基因a1075c位点的多态位点碱基，为野生纯合子aa；b-③的箭头所指碱基为vkorc1基因-1639g>a位点的多态位点碱基，为杂合子ga；b-④为vkorc1基因-1639g>a位点相应的酶切内对照序列ccagg，其a1075c位点/-1639g>a位点基因型＝aa/ga。c-①为cyp2c9基因a1075c位点相应的酶切内对照序列ccagg；c-②的箭头所指碱基为cyp2c9基因a1075c位点的多态位点碱基，为野生纯合子aa；c-③的箭头所指碱基为vkorc1基因-1639g>a位点的多态位点碱基，为野生型纯合子gg；c-④为vkorc1基因-1639g>a位点相应的酶切内对照序列ccagg，其a1075c位点/-1639g>a位点基因型＝aa/gg。d-①为cyp2c9基因a1075c位点相应的酶切内对照序列ccagg；d-②的箭头所指碱基为cyp2c9基因a1075c位点的多态位点碱基，为杂合子ac；d-③的箭头所指碱基为vkorc1基因-1639g>a位点的多态位点碱基，为突变型纯合子aa；a-④为vkorc1基因-1639g>a位点相应的酶切内对照序列ccagg，其a1075c位点/-1639g>a位点基因型＝ac/aa。e-①为cyp2c9基因a1075c位点相应的酶切内对照序列ccagg；e-②的箭头所指碱基为cyp2c9基因a1075c位点的多态位点碱基，为杂合子ac；e-③的箭头所指碱基为vkorc1基因-1639g>a位点的多态位点碱基，为杂合子ga；e-④为vkorc1基因-1639g>a位点相应的酶切内对照序列ccagg，其a1075c位点/-1639g>a位点基因型＝ac/ga。f-①为cyp2c9基因a1075c位点相应的酶切内对照序列ccagg；f-②的箭头所指碱基为cyp2c9基因a1075c位点的多态位点碱基，为杂合子ac；f-③的箭头所指碱基为vkorc1基因-1639g>a位点的多态位点碱基，为野生型纯合子gg；f-④为vkorc1基因-1639g>a位点相应的酶切内对照序列ccagg，其a1075c位点/-1639g>a位点基因型＝ac/gg。测序测出的基因型结果与图3使用本法判断的基因型结果完全一致，说明了本方法对于不同样品cyp2c9基因a1075c位点和vkorc1基因-1639g>a位点基因分型的准确性高。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>广东药科大学<120>一种同时检测cyp2c9和vkorc1基因的试剂盒及其应用<130><160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列<400>1gtgttattattgataagtaaggacttaccca31<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<400>2tagcaaagttgacagattaacatcatcaga30<210>3<211>38<212>dna<213>人工序列<400>3cttcctgtcttcctttattgaagagaattttctccact38<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列<400>4gtaaatgaattttctgtagtaggtggggagaaggtcca38<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列<400>5cacactctctagaagagagtagatgtgag29<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gggccagatgaggtctctcc20<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列<400>7ctctctagaagagagtagatgtgagaaacagcatctgga39<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<400>8gtcttaaactcctgacctcaagtgatccacccacctgg38当前第1页12