一种氨基酸消旋酶及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种嗜热氨基酸消旋酶及其应用。

背景技术：

除甘氨酸外，自然界常见的19种氨基酸均含有α-碳，具有l-型和d-型两种对映异构体。尽管d-氨基酸不是构成蛋白质的基本结构单元，但许多植物、动物、微生物都含有d-氨基酸，具有重要生理功能。如d-氨基酸是组成细菌细胞壁肽聚糖骨架、磷壁酸和聚-γ-谷氨酸等的结构单元；一些d-氨基酸可作为信号分子调节细菌的生长和代谢，如d-leu在特定环境下可引起细胞膜的解体；含有d-天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等d-型氨基酸的多肽，因具有抗菌活性而应用于临床等。

d-氨基酸在食品、化妆品和医药等领域应用广泛。如在食品领域，d-氨基酸构成的二肽或者短肽是高甜度、安全、无热量的甜味剂；在化妆品领域，d-氨基酸被应用于保湿剂、护发剂和染发剂等；在医药领域，d-氨基酸及其衍生物是合成抗菌、抗病毒药物和杀虫剂的重要中间体。

细胞内d-氨基酸的合成主要有两种方法。一是氨基酸消旋酶催化l-氨基酸的构象反转，合成外消旋体(dl-氨基酸)，必须经过手性分离才能得到光学纯的d-氨基酸；二是d-氨基酸转氨酶催化氨基转移至α-酮酸生成相应的d-氨基酸，但该反应需要d-氨基供体。因此，将氨基酸消旋酶与d-氨基酸转氨酶级联是高效合成d-氨基酸的重要方法。如bae等利用bacillussp.sk-1谷氨酸消旋酶将l-谷氨酸转化为dl-谷氨酸作为d-氨基供体，再通过级联bacillussp.sk-1d-氨基酸转氨酶将d-谷氨酸的氨基转移给苯丙酮酸，生成产物d-苯丙氨酸和副产物α-酮戊二酸(j.mol.catal.b:enzym,2002,12,85-92)。

目前已报道的氨基酸消旋酶多来源于中温微生物，且底物谱较窄，如丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、丝氨酸消旋酶和天冬氨酸消旋酶等。因此，开发具有较广底物谱、热稳定的氨基酸消旋酶对于氨基酸对映体的相互转化，尤其是d-氨基酸合成具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种底物谱广且热稳定的氨基酸消旋酶。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明研究发现在ncbi中被假设为aspartateaminotransferasefamilyprotein的多肽(氨基酸序列如seqidno.1所示)，其实际功能为氨基酸消旋酶，故将其命名为嗜热氨基酸消旋酶(tkaar)。

本发明提供了氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽ⅰ或与seqidno.1所示氨基酸序列具有至少70％同一性且具有催化氨基酸消旋功能的多肽ⅱ在酶法催化氨基酸异构体消旋中的应用。

本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在c末端或者n末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。故seqidno.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加几个氨基酸且具有催化氨基酸消旋功能的多肽也属于本发明保护范围。

另外，在seqidno.1所示氨基酸序列的多肽ⅰ的基础上的活性片段、或其活性衍生物、类似物也属于本发明保护范围。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性类似物”是指基本上保持与seqidno.1所示多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

作为优选，所述氨基酸异构体为l-亮氨酸、d-亮氨酸、l-甲硫氨酸或d-甲硫氨酸。研究表明，相较于其他氨基酸，tkaar对leu、met的消旋酶活力更高。

所述的应用包括：以包含包含编码多肽ⅰ或多肽ⅱ的核苷酸序列的重组菌经培养后获得湿菌体，细胞破碎后提取的酶作为催化剂，以leu或met对映异构体为底物，30-90℃、ph3.0-9.0条件下进行消旋反应。反应体系中添加5’-磷酸吡哆醛(plp)作为氨基酸消旋酶的辅酶。

作为优选，反应体系中，leu或met对映异构体的浓度为5-50mm，酶的用量为1-4μg/ml，5’-磷酸吡哆醛的浓度为0.2mm。更为优选，反应体系中，leu或met对映异构体的浓度为10mm，酶的用量为4μg/ml。

作为优选，采用ph5.0的醋酸钠缓冲液，反应温度为75℃。

所述重组宿主细胞可以为原核细胞，如古细菌细胞、细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞，优选地为嗜热球菌、大肠杆菌、酵母。

所述重组菌中具有包含多肽ⅰ或多肽ⅱ编码序列和强启动子的重组载体，其原始载体可以为本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主细胞中稳定复制和存在，任何载体都可以构建重组表达载体。

作为优选，宿主细胞为嗜热球菌thermococcuskodakarensiskpd1，重组载体的原始质粒为prpg02，所述强启动子为pcsg。

本发明还提供了编码上述多肽的核苷酸序列，所述核苷酸为dna或rna。dna形式包括cdna、基因组dna或者人工合成的dna。dna可以单链或者是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码链中编码seqidno.1所示多肽的编码区序列可以是与seqidno.2所示的序列相同或简并的变异体，简并变异体是指编码具有seqidno.1多肽，但与seqidno.2所示的序列有差异的核苷酸序列。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种嗜热氨基酸消旋酶，对leu、met等多种氨基酸异构体具有消旋活性，且具有热稳定性，可将其应用到酶催化l-leu/d-leu、l-met/d-met的消旋化，对于实现氨基酸对映体的相互转化具有重要意义。

附图说明

图1为纯化的氨基酸消旋酶的sds-page电泳结果图，其中m为蛋白marker；泳道1为纯化的氨基酸消旋酶。

图2为温度对氨基酸消旋酶活力的影响。

图3为氨基酸消旋酶的温度稳定性。

图4为ph对氨基酸消旋酶活力的影响，其中a图以d-leu为底物，b图以l-leu为底物。

图5为氨基酸消旋酶催化leu的反应进程，其中a图以d-leu为底物，b图以l-leu为底物。

图6为氨基酸消旋酶催化met的反应进程，其中a图以d-met为底物，b图以l-met为底物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

1、重组表达载体的构建

将所述编码基因tkaar(核苷酸序列如seqidno.2所示)连接至克隆载体puc118，连接产物转化入大肠杆菌escherichiacolidh5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的lb平板培养基。挑取单菌落后接入lb液体培养基培养并提取质粒测序，测序结果正确者即为克隆载体puc118-tk1211。

用ndei和sali双酶切处理重组克隆载体puc118-tk1211和含有强启动子pcsg的ess00988载体，将双酶切后的目的基因和载体于16℃过夜连接。连接产物转化入大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞中，复苏后涂布于含氨苄青霉素的lb平板培养基。挑取单菌落，接入lb液体培养基培养，提取质粒并测序，测序结果正确者即为重组载体ess00988-tk1211。

以上述重组载体为模板，克隆得到含tk1211基因和强启动子pcsg的dna片段pcsgtk1211，将其连接到puc118质粒上，连接产物热击转化入大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞中，复苏后涂布于含氨苄青霉素的固体lb平板培养基。挑取单菌落，接入lb液体培养基培养，提取质粒并测序，测序结果正确者即为克隆载体puc118-pcsgtk1211。

随后用ecorⅰ和sphⅰ双酶切处理t.kodakarensis-e.coli穿梭质粒prpg02和puc118/pcsgtk1211克隆载体，随后16℃过夜连接，连接产物热击转化入大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞中，复苏后涂布于含氨苄青霉素的固体lb平板培养。挑取单菌落，接入lb液体培养基孵育，pcr验证目的基因条带正确后提取质粒测序，测序结果正确者即为重组表达载体prpg02-pcsgtk1211。

2、重组转化体的构建

采用转化法将所述重组表达载体prpg02-pcsgtk1211转化入宿主细胞t.kodakarensiskpd1(δpyrf,δpdad)。转化流程如下：在85℃及无氧条件下，t.kodakarensiskpd1于添加0.5mm精胺的asw-yt-s⁰液体培养基中生长12-16h，无氧条件下取5ml培养液离心，弃去培养基后用200μl0.8×asw重选，静置于冰上1h。随后加入步骤1中的重组表达载体3μg，冰上静置0.5h，并将其涂布于asw-yt固体培养基，85℃及无氧条件下培养24h。挑取单菌落，接入asw-yt-s⁰液体培养基中，pcr验证目的条带正确者即为重组转化体t.kodakarensis/prpg02-pcsgtk1211。人工海水asw及培养基asw-yt-s⁰的组成见参考文献j.biol.chem.,2018,293,3625-3636。

3、嗜热氨基酸消旋酶的表达与纯化

步骤2中的重组转化体接种至asw-yt-s⁰液体培养基，在85℃及无氧条件下培养12h，随后以1％接种量转接至asw-yt-pyr培养基中培养12-14h。随后于5000×g下离心10min收集菌体细胞，收集到的菌体细胞重悬于含20mm磷酸盐(ph7.4)，0.2mmplp，500mmkcl和20mm咪唑的平衡缓冲液中，超声波破碎。破碎液离心(15000×g，20min)后取上清液进行镍柱纯化处理，所用洗脱缓冲液为20mm磷酸盐(ph7.4)，0.2mmplp，500mmkcl和250mm咪唑。纯化所得蛋白采用sds-page凝胶电泳验证(图1)。

4、嗜热氨基酸消旋酶的底物特异性

测定步骤3中获得的嗜热氨基酸消旋酶对d/l型氨基酸的底物特异性。反应体系(300μl)组成为50mm醋酸钠缓冲液(ph5.0),0.2mmplp，10mmd型或l型氨基酸和2μg/ml纯化的重组酶。反应液于75℃反应1h，取样100μl，加入50μl1mhcl终止反应，并用超纯水稀释至1ml。取稀释样品25μl与175μl硼酸-氢氧化钠缓冲液(ph10.4)和50μl衍生化试剂(8mg邻苯二甲醛(opa)和10mgn-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)溶解于1ml甲醇)混合，黑暗处室温静置2min后经高效液相色谱(hplc)分析测定酶活。

该嗜热氨基酸消旋酶对各种氨基酸的活力见表1(无活力的氨基酸未列出)，结果表明其对leu、met、ala、phe等多种氨基酸具有消旋酶活力，最适底物为d-leu和l-leu。

表1氨基酸消旋酶的底物特异性

5、嗜热氨基酸消旋酶最适反应温度及温度稳定性

分别以d-leu和l-leu为底物，加入步骤3中纯化的氨基酸消旋酶测定最适反应温度，反应体系(300μl)如下：50mm醋酸钠缓冲液(ph5.0),0.2mmplp，20mmd-leu或l-leu和2μg/ml纯化的重组酶，反应温度为30-90℃。结果如图2所示，最适反应温度为75℃。

将步骤3中纯化的氨基酸消旋酶分别置于70℃、80℃和90℃，进行温度稳定性的测定。每隔一定时间取适量的重组酶测定对d-leu的残余活力，结果如图3所示。该嗜热氨基酸消旋酶在70℃下具有良好的稳定性，放置10h仍具有80％以上的残余活力。

6、嗜热氨基酸消旋酶最适反应ph

分别以d-leu和l-leu为底物，加入实施例3中纯化的重组酶测定最适反应ph。反应体系(300μl)如下：50mm缓冲液(ph3.0-9.0),0.2mmplp，20mmd-leu或l-leu和2μg/ml纯化的重组酶，反应温度为75℃。结果如图4所示，图4a为d-leu为底物时ph对酶活的影响，图4b为l-leu为底物时ph对酶活的影响，最适反应ph均为5.0。

应用例1嗜热氨基酸消旋酶催化leu对映体消旋

分别以d-leu和l-leu为底物，加入实施例1步骤3中纯化的重组酶进行消旋反应。反应体系(5ml)为：50mm醋酸钠缓冲液,0.2mmplp，10mmd-leu或l-leu和4μg/ml纯化的重组酶。hplc分析测定对应的对映体生成量以及底物剩余浓度。

结果如图5所示，图5a为d-leu作为底物时的反应进程，图5b为l-leu作为底物时的反应进程。反应4h，两个反应均趋于平衡，d-leu和l-leu的终浓度都趋于1:1。

应用例2嗜热氨基酸消旋酶催化met对映体消旋

分别以d-met和l-met为底物，加入实施例1步骤3中纯化的重组酶进行消旋反应。反应体系(5ml)为：50mm醋酸钠缓冲液,0.2mmplp，10mmd-met或l-met和4μg/ml纯化的重组酶。hplc分析测定对应的对映体生成量以及底物剩余浓度。

结果如图6所示，图6a为d-met作为底物时的反应进程，图6b为l-met作为底物时的反应进程。反应6h，两个反应均趋于平衡，d-met和l-met的终浓度都趋于1:1。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种氨基酸消旋酶及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>443

<212>prt

<213>嗜热球菌(thermococcuskodakarensis)

<400>1

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151015

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<213>嗜热球菌(thermococcuskodakarensis)

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