一种固定化全细胞及其制备方法与在产3-氨基丙酸中的应用与流程

本发明属于全细胞催化和微生物固定化领域，具体涉及一种固定化全细胞及其制备方法与在产3-氨基丙酸中的应用。

背景技术：

3-氨基丙酸，又称为β-丙氨酸，是唯一的一种天然β型氨基酸，在生物体中有着很重要的生理功能，并且是泛酸合成过程中不可或缺的媒介。3-氨基丙酸作为最具潜力的三碳化合物之一，被广泛的应用于医药、建筑、食品等多个领域。当前，化学合成3-氨基丙酸过程中存在的反应条件苛刻、污染严重、转化率低等问题，使得生物酶法合成3-氨基丙酸受到广泛的关注。以l-天冬氨酸作为底物，用全细胞催化的方式来合成3-氨基丙酸是一个较为明智的选择，它具有很多优势，如高稳定性、节约成本及节省时间等。然而，全细胞催化的方式存在酶活性低、存在底物产物抑制、耐受性差等问题限制其在3-氨基丙酸生物合成中的应用。

金属-有机框架材料是金属离子或金属簇与有机配体组成的，具有一定尺寸和多孔结构的纳米材料。金属-有机框架材料具有超高的比表面积、高的孔隙率、容易修饰的特点和较高的热稳定性，在催化、物质吸附、离子交换、气体储存等方面展现出广阔的应用价值。通过将金属-有机框架材料附着于微生物表面，对微生物进行固定化和功能化，可以提高微生物在生物催化过程中的稳定性、耐受性、可控性和催化活性。因此本研究基于固定化微生物的角度，以金属-有机框架材料固定化大肠杆菌进而大肠杆菌在生物催化过程中的催化活性和耐受性，进而提高大肠杆菌生物催化产3-氨基丙酸的产量。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，大肠杆菌在生物催化产3-氨基丙酸过程中产量低和菌体耐受性低的问题，提供一种固定化全细胞制备3-氨基丙酸的方法，该方法对于3-氨基丙酸的产量有了明显的提升，并且显著提升了生物催化过程中的菌体耐受性。

发明思路：利用金属-有机框架材料与微生物共沉淀法制备出金属-有机框架材料固定化全细胞，利用不同金属离子对于细胞中承担催化作用的酶的促进和激活作用，提升微生物细胞的催化活性，利用形成的金属-有机框架材料对细胞进行保护作用，提升微生物细胞在生物催化过程中的耐受性和重复利用率，进而提升3-氨基丙酸的产量。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种固定化全细胞的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将l-天冬氨酸脱羧酶菌株培养，离心，得到菌体；

(2)用水将步骤(1)得到的菌体重悬，得到细胞重悬液；

(3)将步骤(2)得到的细胞重悬液与离子溶液混合，再加入配体溶液，搅拌，洗涤，将洗涤后的固体部分沉淀，所得沉淀物即为固定化全细胞。

步骤(1)中，构建l-天冬氨酸脱羧酶菌株的方法包括如下步骤：

(i)提取谷氨酸棒杆菌c.glutamicumatcc13032、大肠杆菌mg1655及b.subtilis中的基因组，以这三种基因组为模板，pcr扩增adc基因pand，得到pcr产物；

(ii)将步骤(i)得到的pcr产物经琼脂糖回收，用ncoi、xhoi双酶切；

(iii)将pet28a载体载体进行双酶切；

(iv)用t4dna连接酶将步骤(ii)得到的目的片段连接到酶切后的载体上，得到重组质粒pet28a-pandc.g；

(v)将步骤(iv)得到的重组质粒pet28a-pandc.g转化到大肠杆菌de3中，筛选出单菌落，即为l-天冬氨酸脱羧酶菌株。

步骤(1)中，所述的培养包括如下步骤：

(a)平板培养：将单菌落在平板培养基上划线操作，然后将平板放于37℃恒温培养8～12h；

(b)种子液培养：向50ml离心管中加入5mllb培养基，加入10μl的25mg/l卡那霉素，挑取10μl左右的甘油冻存菌(步骤(a)得到的)进行接种，在200r/min、37℃的条件下培养8-10h；

(c)摇瓶发酵培养：向500ml摇瓶中加入100mllb培养基，加入200μl的25mg/l卡那霉素，将步骤(2)得到的种子液按照0.3％～3％v/v(优选1％v/v)的接种量为接入其中，转速为200r/min，温度为37℃，培养至od600＝0.4-0.6时，向其中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，使iptg的终浓度达到0.5mmol/l，200r/min，30℃条件下诱导10h后，离心收菌体。

步骤(2)中，用水重悬菌体至5～15od。

步骤(3)中，所述的离子为二价金属离子；离子溶液的浓度为20～100mmol/l，溶剂为水；细胞重悬液与离子溶液的体积比为1.5～3:1(优选2:1)。

其中，所述的二价金属离子优选锌离子、二价铁离子和钴离子中的任意一种或几种组合，更优选钴离子。

步骤(3)中，所述的配体为咪唑或咪唑衍生物(优选二甲基咪唑)；配体溶液的浓度为50～200mmol/l，溶剂为水；配体溶液与离子溶液的体积比为1:0.5～2(优选1:1)。

步骤(3)中，所述的搅拌为在200～800rpm(优选500rpm)的转速下搅拌30～60min。

上述述方法制备得到的固定化全细胞也在本发明的保护范围之内。

上述固定化全细胞在产3-氨基丙酸中的应用也在本发明的保护范围之内，其包括如下步骤：向pbs缓冲液中加入上述固定化全细胞，反应。

其中，控制固定化全细胞的用量，使每1mlpbs缓冲液中固定化全细胞的细胞浓度为od600＝0.1～5。

其中，所述的反应为在30～40℃下50～300rpm振荡反应8～12h(优选10h)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1.以一种低成本的、易合成、可控性好的方式得到了固定化全细胞生产3-氨基丙酸的体系。

2.通过固定化全细胞的方法，提高了细胞的在催化体系中的催化活性、耐受性和重复利用率。

3.利用金属-有机框架材料与微生物细胞的组合，兼具生物活性和纳米材料特性的优点，这种组合设计和生物相容性好、制备简单、可设计性强。

附图说明

图1为实施例1与实施例2的在不同温度下3-氨基丙酸产量的对比图。

图2为实施例1与实施例2的不同ph下产3-氨基丙酸产量的对比图。

图3为实施例1与实施例2的重复利用率对比图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1产l-天冬氨酸脱羧酶菌株的构建和培育过程^[1～3]

1.1菌株的构建

提取c.glutamicum、e.colimg1655及b.subtilis中的基因组，以这三种基因组为模板，通过pcr扩增adc基因pand(见表1)，pcr产物经过琼脂糖回收，用ncoi、xhoi双酶切，然后用t4dna连接酶连接到同样经过双酶切的pet28a载体上，构建重组质粒pet28a-pandc.g，转化到e.colibl21(de3)中，卡那平板筛选出单菌落。

表1

1.2培养基

平板培养基(l^-1)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，琼脂20g，卡那霉素0.05g，溶剂为水。

lb培养基(l^-1)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，卡那霉素0.05g，溶剂为水。

灭菌方法：对抗生素进行过滤除菌，其余进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，20min。

1.3平板培养

将储存于-80℃冰箱内的菌株取出，在平板培养基上进行划线操作，然后将平板放于37℃恒温培养箱内，培养8-12h。

1.4种子液培养

向50ml离心管中加入5mllb培养基，加入10μl的25mg/l卡那霉素，挑取10μl左右的甘油冻存菌进行接种，在200r/min、37℃的条件下培养8-10h。

1.5摇瓶发酵培养

向500ml摇瓶中加入100mllb培养基，加入200μl的25mg/l卡那霉素，接种量为1％，转速为200r/min，温度为37℃，培养至od600＝0.4-0.6时，向其中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，使iptg的终浓度达到0.5mmol/l，200r/min，30℃条件下诱导10h后，离心收菌。

[1]duschn,kalinowskir.expressionofthecorynebacteriumglutamicumpandgeneencodingl-aspartate-alpha-decarboxylaseleadstopantothenateoverproductioninescherichiacoli[j].applied&environmentalmicrobiology,1999,65(4):1530-1539.

[2]高丽娟,裘娟萍.l-天冬氨酸-a-脱羧酶研究进展[j].工业微生物,2007,37(5):54-59.

[3]赵连真,张梁,石贵阳等.谷氨酸棒杆菌l-天冬氨酸-α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸[j].微生物学通报,2013,40(12):2161-2170.

实施例2固定化全细胞的制备过程

2.1菌株的构建

参见实施例1中1.1菌株的构建

2.2培养基

参见实施例1中1.2培养基

2.3平板培养

参见实施例1中1.3平板培养

2.4种子液培养

参见实施例1中1.4种子液培养

2.5摇瓶发酵培养

参见实施例1中1.5摇瓶发酵培养

2.6固定化全细胞的制备

将收集得到菌泥用水重悬，获得浓度od600＝15的细胞重悬液，将10ml浓度od600＝15的细胞重悬液与5ml45mmol/l的钴离子溶液混合15分钟后，加入5ml80mmol/l的二甲基咪唑溶液，在室温下以500rpm的转速搅拌30～60分钟，随后用水洗涤离心留沉淀，即得到金属-有机框架材料固定化的全细胞。

实施例3分析方法

3.1催化生产3-氨基丙酸的方法

在10mlpbs缓冲溶液中，分别加入实施例1制备的全细胞和实施例2制备的金属-有机框架材料固定化的全细胞，使细胞浓度为od600＝5，35℃200rpm振动反应10h。脱羧反应结束后，离心去除细胞菌体，取上清进行液相检测。

3.2检测3-氨基丙酸的方法

取样品100μl，依次加入100μl0.5mol/l碳酸氢钠溶液(ph9.0)，100μl1％2,4-二硝基氟苯乙腈溶液，放于60℃摇床中避光反应1h后，加入700μl0.05mol/lpbs缓冲液(ph7.0)。12000rpm高速离心10min，取上清液进行液相分析。

液相分析条件：色谱柱为agilenttechnologytc-c18柱(5μm，4.6mm×250mm)，流动相分别为0.02mol/l的ph6.2naac-hac缓冲液(a)和乙腈(b)；线性梯度洗脱，流动相b浓度(体积百分含量)0→25min内由5％升高至33％，流速为1.0ml/min；柱温为30℃，检测波长为360nm，参比波长为600nm；样品进样量为20μl。

实施例4催化活性及耐受性对比

1、对于温度的耐受性检测，控制反应温度在25℃～45℃之间，探究不同温度对生物转化产3-氨基丙酸的影响，其他条件同3.1。

图1结果表明在热稳定性方面，实施例2中的金属-有机框架材料固定化的全细胞比实施例1中的全细胞生物催化有了明显的提升，实施例2中的金属-有机框架材料固定化的全细胞对生物转化产3-氨基丙酸的产量达到了每小时3.5g/l。

2、对于ph的耐受性检测，采用不同类型缓冲液中进行，如酸性缓冲液，碱性缓冲液，控制反应ph在4～8之间，探究不同ph对生物转化产3-氨基丙酸的影响，其他条件同3.1。

图2结果表明实施例2中的金属-有机框架材料固定化的全细胞对生物转化产3-氨基丙酸的在ph4时保持产量为每小时2.3g/l，在ph8时保持产量为每小时3.1g/l，远高于实施例1中的全细胞生物转化产3-氨基丙酸速率。

3、对于重复利用性能的检测，每次催化周期为3小时，以实施例1和实施例2的最优催化情况为100％，记录两者的相对催化活性保留情况。

图3结果表明在重复利用率方面，实施例2中的金属-有机框架材料固定化的全细胞方案较实施例1中的全细胞生物催化有了明显的提升效果，在重复利用5次后时仍能保持自身55％的催化活性。

综上所述，本发明一种固定化全细胞制备3-氨基丙酸的方法，基于金属-有机框架纳米材料固定化微生物的角度，提高了全细胞催化的催化活性、耐受性和重复利用率，进而提升3-氨基丙酸的产量。

本发明提供了一种固定化全细胞及其制备方法与在产3-氨基丙酸中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。