1.一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物,其特征在于,包括如下的通过调节mirna以影响靶基因表达的snps:rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432;
以forward与reverse为引物,p-x为探针,对rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432进行基因分型的探针及引物如下:
rs7110737:forward:5’-ttgactcattttgtcatgatcctt-3’;
rs7110737:reverse:5’-tgatattgtcacccaatctgttagg-3’;
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rs7110737:p-a:5’-hex-ttaggtgcatctcatatt-mgb-3’;
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rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’。
2.一种筛选在肺癌遗传易感机制中发挥生物功能学作用的阳性regqtls的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)根据肿瘤基因组图谱数据库下载肺癌相关基因和微小rna的表达数据以及单核苷酸多态性基因分型数据,通过通路分析等生物信息学技术预测通过调节mirna以影响靶基因表达的regqtl-mirna-mrna关系对;然后,根据p<1.0×10-4和pfdr<0.2这两个标准进一步对数据进行筛选,得到初始regqtl-mirna-mrna关系对;
(b)将步骤(a)中的初始regqtl-mirna-mrna关系对,通过targetscan和mirtarbase软件进一步预测mirna和mrna的相互结合作用,将两个软件所得结果取交集,选取相互作用强的regqtl-mirna-mrna关系对;
(c)通过基因-组织表达数据库对步骤(b)中所得关系对中的regqtls进行表达数量性状位点分析,根据p<0.05筛选出了能够潜在通过调节mirna影响靶基因表达水平的regqtls;
(d)利用连锁不平衡分析,根据r2<0.80的标准对步骤(c)中筛选出的regqtls进行连锁不平衡分析,得到最终的能够潜在通过调节mirna影响靶基因表达的候选regqtls。
3.一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物的应用,其特征在于,用于制备肺癌辅助诊断试剂盒。
4.根据权利要求3所述的与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物的应用,其特征在于,所述试剂盒的制备方法包括如下步骤:
(1)提取外周血基因组dna:
(1-1)向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂,颠倒混匀后完全转入5mlep管中;
(1-2)用溶血试剂将5mlep管补至4ml,颠倒混匀,4000rpm离心10分钟,弃上清;
(1-3)向沉淀中加入4ml溶血试剂,再次颠倒混匀清洗一次,4000rpm离心10分钟,弃上清;
(1-4)向沉淀中加1ml抽提液和8ul蛋白酶k,震荡器上充分震荡混匀,37℃水浴过夜;
(1-5)加1ml饱和酚充分混匀,4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5mlep管中;
(1-6)在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液,充分混匀后,4000rpm离心10分钟,取上清分入两个1.5mlep管中;
(1-7)在上清液中加入3m的醋酸钠70ul,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇,上下轻摇,可见白色絮状沉淀物,再以12000rpm离心10分钟;
(1-8)在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10分钟,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干;
(1-9)干燥后产物加入te缓冲液100ul溶解,置4℃冰箱一周后进行浓度测定并转入-20℃冰箱保存备用。
(2)通过taqman基因分型系统对候选regqtls进行基因分型:
(2-1)探针引物设计
以forward与reverse为引物,p-x为探针,对rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432进行基因分型的探针及引物如下:
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rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’;
(2-2)制备taqman基因分型所需试剂:正、反向引物,探针,taqman2×pcrmastermix和双蒸水;
(2-3)实时荧光定量pcr扩增
每块96孔反应平板每孔为10ul反应体系,其中dna样本的浓度不低于5ng/ul;采用高透光度盖膜覆盖反应板,短暂离心以去除气泡,装入基因分型平台进行分型检测;具体反应条件如下:
95℃10min;
95℃15s,60℃1min,40个循环;
4℃∞;
扩增循环结束后,读取扩增后荧光信号,运用sds2.0软件进行基因型判读。