一种与肺癌相关的外周血regQTLs生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于分子流行病学及肿瘤学领域，具体涉及一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物及其应用。

背景技术：

根据最新的癌症统计报告，2018年全球新增1810万例癌症病例和960万例癌症死亡，其中肺癌仍是全世界最常见的癌症和因癌症死亡的主要原因。同时，肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一。由于持续增长的烟草消费、严重的环境污染以及生活方式的改变，肺癌已严重威胁到我国居民的生命健康。近二十年来，我国肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势。随着人口基数的增大和居民期望寿命的延长，巨大的肺癌患病和死亡人数，仍然是我国在未来相当长一段时期内的严重疾病负担之一。

流行病学研究表明，肺癌的形成是一个多因素、多阶段的过程，是环境因素和个体遗传因素相互作用的结果。毫无疑问，环境暴露(例如吸烟、厨房油烟等)会增加肺癌的发病风险，其中80％以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20％的吸烟者发生肺癌，这说明在相同的环境暴露水平下，遗传因素将在一定程度上决定个体对肺癌的易感程度。肺癌家庭聚集性研究也显示，遗传因素在肺癌的发生发展中起着重要作用，主要是单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)。snp是人类基因组最常见的遗传变异之一，是指单个核苷酸的替代、插入或缺失而形成的基因多态，决定着大多数生物性状的个体差异，是个体对肿瘤等疾病易感性的重要遗传学基础。因此，开展肺癌遗传易感性研究将有助于揭示肺癌的遗传易感机制，所发现的遗传易感标志物有望用于预测个体肺癌发生风险，以进一步确定肺癌高危人群从而更好的实现早期筛查和早期诊断的肺癌防治目标。

微小rna(microrna，mirna)是一类重要的非编码rna，能够通过识别靶mrna上的靶序列，从而与其结合并影响靶基因的表达，这会导致转录物难以转化为蛋白质或在细胞中降解。因为这些分子相互作用是通过碱基配对实现的，它们可能受到遗传变异的影响，基因组序列的变化可能会影响结合能和退火强度。所以，mirna和靶位点序列的多态性与异常的mirna-mrna相互作用有关，并且与多种癌症有关。这表明遗传变异、mirna调节和疾病之间存在一定的关联。最近的全基因组关联研究(genome-wideassociationstudy，gwas)表明，mirna结合位点的多态性增加了乳腺癌和结直肠癌等癌症的风险。此外，还有研究表明mirna调控网络中的多态性能影响临床治疗效果。这些能够通过调控mirna从而影响靶基因表达的snp被定义为“regqtl”。但是由于regqtls主要是通过生物信息学分析得到的，其是否真正具有生物学功能并影响肺癌的遗传易感性有待进一步明确。

近年来，关于疾病易感性的研究大多采用候选基因的策略，针对候选基因进行基因多态性对疾病发生风险、治疗或者预后的探讨。该策略虽然能寻找到疾病相关snp位点，但难以对其机制功能学进行深入研究。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是通过全基因组筛选，提供一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物及其应用，为探寻肺癌发生发展机制中的重要生物标志物和治疗靶点提供可靠的依据，并为开展肺癌早筛查、早期个性化干预奠定科学基础。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物，包括如下的通过调节mirna以影响靶基因表达的snps：rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432；

以forward与reverse为引物，p-x为探针，对rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432进行基因分型的探针及引物如下：

rs7110737:forward:5’-ttgactcattttgtcatgatcctt-3’；

rs7110737:reverse:5’-tgatattgtcacccaatctgttagg-3’；

rs7110737:p-t:5’-fam-ttaggtgcatctctta-mgb-3’；

rs7110737:p-a:5’-hex-ttaggtgcatctcatatt-mgb-3’；

rs273957:forward:5’-tcagagtgacagacggaacga-3’；

rs273957:reverse:5’-cccttcaacatccatcaagaca-3’；

rs273957:p-t:5’-fam-tcgtctgtaattggct-mgb-3’；

rs273957:p-c:5’-hex-ttcgtctgtaactggct-mgb-3’；

rs6593210:forward:5’-ctacccctgctgactaactgtg-3’；

rs6593210:reverse:5’-taactgaaatctctggtccttggac-3’；

rs6593210:p-g:5’-fam-ccagcacgttcac-mgb-3’；

rs6593210:p-a:5’-hex-ccagcacattcac-mgb-3’；

rs3768617:forward:5’-caagaagctattggagggtttaaaagt-3’；

rs3768617:reverse:5’-cacctgctcccctacaatgg-3’；

rs3768617:p-g:5’-fam-tttggctttcatgttgag-mgb-3’；

rs3768617:p-a:5’-hex-tttggctttcatgttaag-mgb-3’；

rs6836432:forward:5’-catgagccaatgtctgctagctt-3’；

rs6836432:reverse:5’-cctaatccagagaaagactctagctctt-3’；

rs6836432:p-g:5’-fam-ttcctcaacatagttca-mgb-3’；

rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’。

其中，在肺癌遗传易感机制中发挥生物功能学作用的regqtls筛选方法包括如下步骤：

(a)根据肿瘤基因组图谱(tcga)数据库下载肺癌相关基因(mrna)和微小rna(mirna)的表达数据以及单核苷酸多态性(snp)基因分型数据，通过通路分析等生物信息学技术预测可能通过调节mirna以影响靶基因表达的regqtl-mirna-mrna关系对，共72,314对；接着，根据p<1.0×10^-4和pfdr<0.2这两个标准进一步对数据进行筛选，得到1,723个初始regqtl-mirna-mrna关系对；

(b)将步骤(a)中的1,723个初始regqtl-mirna-mrna关系对，通过targetscan和mirtarbase软件进一步预测mirna和mrna的相互结合作用，将两个软件所得结果取交集，选取相互作用强的regqtl-mirna-mrna关系对，共55对；

(c)通过基因-组织表达(gtex)数据库对步骤(b)中所得关系对中的regqtls进行表达数量性状位点分析(即分析regqtls是否在肺组织中能够影响其相应基因的表达水平)，根据p<0.05筛选出了6个能够潜在通过调节mirna影响靶基因表达水平的regqtls；

(d)利用连锁不平衡分析(即等位基因关联，当位于同一条染色体的两个等位基因(a，b)同时存在的概率大于人群中因随机分布而同时出现的概率时，就称这两个位点处于连锁不平衡状态)，根据r²<0.80的标准对步骤(c)中的6个regqtls进行连锁不平衡分析，最终得到5个能够潜在通过调节mirna影响靶基因表达的候选regqtls。

本发明还提供一种上述的与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物的应用，用于制备肺癌辅助诊断试剂盒。

其中，所述试剂盒的制备方法包括如下步骤：

(1)提取外周血基因组dna：

(1-1)向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入5mlep管中；

(1-2)用溶血试剂将5mlep管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清；

(1-3)向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清；

(1-4)向沉淀中加1ml抽提液和8ul蛋白酶k，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜；

(1-5)加1ml饱和酚充分混匀(上下颠倒混匀15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5mlep管中；

(1-6)在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1)，充分混匀后(上下颠倒混匀15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清分入两个1.5mlep管中；

(1-7)在上清液中加入3m的醋酸钠70ul，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10分钟；

(1-8)在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10分钟，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干；

(1-9)干燥后产物加入te缓冲液100ul溶解(注意产物不要过干或摆放时间过长，否则dna不易于溶解)，置4℃冰箱一周后进行浓度测定并转入-20℃冰箱保存备用。

(2)通过taqman基因分型系统对候选regqtls进行基因分型：

taqman基因分型技术的原理是利用两个等位基因特异的mgb探针和两个pcr引物，能提供高度可靠和准确的基因分型检出。两个探针的5’端标有不同的荧光(fam或vic)，3’端标有mgb不发荧光的淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的snp等位基因型。

(2-1)探针引物设计

以forward与reverse为引物，p-x为探针，对rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432进行基因分型的探针及引物如下：

rs7110737:forward:5’-ttgactcattttgtcatgatcctt-3’；

rs7110737:reverse:5’-tgatattgtcacccaatctgttagg-3’；

rs7110737:p-t:5’-fam-ttaggtgcatctctta-mgb-3’；

rs7110737:p-a:5’-hex-ttaggtgcatctcatatt-mgb-3’；

rs273957:forward:5’-tcagagtgacagacggaacga-3’；

rs273957:reverse:5’-cccttcaacatccatcaagaca-3’；

rs273957:p-t:5’-fam-tcgtctgtaattggct-mgb-3’；

rs273957:p-c:5’-hex-ttcgtctgtaactggct-mgb-3’；

rs6593210:forward:5’-ctacccctgctgactaactgtg-3’；

rs6593210:reverse:5’-taactgaaatctctggtccttggac-3’；

rs6593210:p-g:5’-fam-ccagcacgttcac-mgb-3’；

rs6593210:p-a:5’-hex-ccagcacattcac-mgb-3’；

rs3768617:forward:5’-caagaagctattggagggtttaaaagt-3’；

rs3768617:reverse:5’-cacctgctcccctacaatgg-3’；

rs3768617:p-g:5’-fam-tttggctttcatgttgag-mgb-3’；

rs3768617:p-a:5’-hex-tttggctttcatgttaag-mgb-3’；

rs6836432:forward:5’-catgagccaatgtctgctagctt-3’；

rs6836432:reverse:5’-cctaatccagagaaagactctagctctt-3’；

rs6836432:p-g:5’-fam-ttcctcaacatagttca-mgb-3’；

rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’；

(2-2)制备taqman基因分型所需试剂：正、反向引物，探针，taqman2×pcrmastermix和双蒸水。

(2-3)实时荧光定量pcr扩增

使用abi7500基因分型平台进行基因分型。每块96孔反应平板每孔为10ul反应体系，具体反应体系如表1。其中dna样本的浓度不低于5ng/ul。采用高透光度盖膜覆盖反应板，短暂离心以去除气泡，装入abi7500基因分型平台进行分型检测。具体反应条件如下：

95℃10min；

95℃15s，60℃1min，40个循环；

4℃∞。

扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用sds2.0软件进行基因型判读。

表1taqman基因分型反应体系

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1、本发明系统地筛选能够通过调节mirna影响靶基因表达的regqtls并确定其与肺癌遗传易感性的关联及其效应值，验证获得阳性regqtls可作为与肺癌遗传易感性相关的外周血标志物。

2、本发明对阳性regqtls及其靶基因和mirna进行功能学注释，以初步阐明阳性regqtl以及regqtl-mirna-mrna影响肺癌发生发展的相互调控模式。

3、本发明有望为探寻肺癌发生发展调控机制中的重要生物标志物和治疗靶点提供可靠的依据，并为开展肺癌早筛查、早期个性化干预奠定科学基础。

附图说明

图1为本发明中5个候选regqtls筛选过程的示意图；

图2为本发明中5个候选regqtls不同基因型对应靶基因的相对表达水平的示意图；

图3为本发明中5个候选regqtls基因分型实验结果图；

图4为本发明中rs3768617-lamc1-mirna-548b-3p相互调控模式图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供了一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物，包括如下的通过调节mirna以影响靶基因表达的snps(regqtls)：rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432；

以forward与reverse为引物，p-x为探针，对rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432进行基因分型的探针及引物如下：

rs7110737:forward:5’-ttgactcattttgtcatgatcctt-3’；

rs7110737:reverse:5’-tgatattgtcacccaatctgttagg-3’；

rs7110737:p-t:5’-fam-ttaggtgcatctctta-mgb-3’；

rs7110737:p-a:5’-hex-ttaggtgcatctcatatt-mgb-3’；

rs273957:forward:5’-tcagagtgacagacggaacga-3’；

rs273957:reverse:5’-cccttcaacatccatcaagaca-3’；

rs273957:p-t:5’-fam-tcgtctgtaattggct-mgb-3’；

rs273957:p-c:5’-hex-ttcgtctgtaactggct-mgb-3’；

rs6593210:forward:5’-ctacccctgctgactaactgtg-3’；

rs6593210:reverse:5’-taactgaaatctctggtccttggac-3’；

rs6593210:p-g:5’-fam-ccagcacgttcac-mgb-3’；

rs6593210:p-a:5’-hex-ccagcacattcac-mgb-3’；

rs3768617:forward:5’-caagaagctattggagggtttaaaagt-3’；

rs3768617:reverse:5’-cacctgctcccctacaatgg-3’；

rs3768617:p-g:5’-fam-tttggctttcatgttgag-mgb-3’；

rs3768617:p-a:5’-hex-tttggctttcatgttaag-mgb-3’；

rs6836432:forward:5’-catgagccaatgtctgctagctt-3’；

rs6836432:reverse:5’-cctaatccagagaaagactctagctctt-3’；

rs6836432:p-g:5’-fam-ttcctcaacatagttca-mgb-3’；

rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’。

其中，在肺癌遗传易感机制中发挥生物功能学作用的regqtls筛选方法包括如下步骤(图1)：

(a)根据肿瘤基因组图谱(tcga)数据库下载肺癌相关基因(mrna)和微小rna(mirna)的表达数据以及单核苷酸多态性(snp)基因分型数据，通过通路分析等生物信息学技术预测可能通过调节mirna以影响靶基因表达的regqtl-mirna-mrna关系对，共72,314对。接着，根据p<1.0×10^-4和pfdr<0.2这两个标准进一步对数据进行筛选，得到1,723个regqtl-mirna-mrna关系对；

(b)将步骤(a)中的1,723个初始regqtl-mirna-mrna关系对，通过targetscan和mirtarbase软件进一步预测mirna和mrna的相互结合作用，将两个软件所得结果取交集，选取相互作用强的regqtl-mirna-mrna关系对，共55对；

(c)通过基因-组织表达(gtex)数据库对步骤(b)中所得关系对中的regqtls进行表达数量性状位点分析(即分析regqtls是否在肺组织中能够影响其相应基因的表达水平)，根据p<0.05筛选出了6个能够潜在通过调节mirna影响靶基因表达水平的regqtls；

(d)利用连锁不平衡分析(即等位基因关联，当位于同一条染色体的两个等位基因(a，b)同时存在的概率大于人群中因随机分布而同时出现的概率时，就称这两个位点处于连锁不平衡状态)，根据r²<0.80的标准对步骤(c)中的6个regqtls进行连锁不平衡分析，最终得到5个能够潜在通过调节mirna影响靶基因表达的候选regqtls。

本发明还提供一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物的应用，用于制备肺癌辅助诊断试剂盒。

本发明拟采用生物信息学分析筛选出在肺癌中能够通过调节mirna影响靶基因表达的regqtls，并采用两阶段病例-对照研究(第一阶段：来自中国人群中的626名肺癌病例与667例健康对照；第二阶段：来自欧洲人群中的18,082名肺癌病例和13,780名健康对照)探讨其与肺癌发病风险的关联，同时对阳性regqtls及其靶基因和mirna进行功能学注释，以初步阐明阳性regqtl以及regqtl-mirna-mrna影响肺癌发生发展的相互调控模式。本发明有望为探寻肺癌发生发展机制中的重要生物标志物和治疗靶点提供可靠的依据，并为开展肺癌早筛查、早期个性化干预奠定科学基础。

一、regqtls与肺癌发病风险的关联研究

1)研究对象

病例组：来自南通市第六人民医院、南通大学附属医院和常熟市第一人民医院明确诊断的新发肺癌病例。纳入标准：汉族人群，年龄、性别不限。排除标准：采血前接受过化疗、放疗，或有既往肿瘤病史。

对照组：参加常规体检的健康人群，按照年龄(±5岁)、性别频数匹配的原则，随机匹配合适对照。排除标准：有呼吸系统疾病或恶性肿瘤病史。目前已完成626例病例和667对照的生物样本收集和流行病学调查。

2)流行病学调查和临床信息采集

病例和对照采用统一设计的结构式流行病学调查问卷进行面访调查。内容包括研究对象一般情况(年龄、性别和职业等)、个人疾病史、肿瘤家族史和生活习惯等。根据统一制定的流行病学资料调查工作手册，培训调查员，统一方法和标准，确保流行病学调查资料的质量。临床资料包括确诊日期、肿瘤病理、tnm分期、治疗方式和日期等。

3)生物标本收集

每个研究对象均采用真空抗凝(edta)采血管采集静脉血5ml(病例要求采集在病人放、化疗前的血标本)，按标准方法在4小时内离心，分别分离血浆、白细胞和红细胞至1.5ml离心管中(均各保存两份)，-80℃冷冻保存备用。

4)基因组dna提取

4.1.向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入5mlep管中；

4.2.用溶血试剂将5mlep管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清；

4.3.向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清；

4.4.向沉淀中加1ml抽提液和8ul蛋白酶k，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜；

4.5.加1ml饱和酚充分混匀(上下颠倒混匀15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5mlep管中；

4.6.在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1)，充分混匀后(上下颠倒混匀15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清分入两个1.5mlep管中；

4.7.在上清液中加入3m的醋酸钠70ul，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10分钟；

4.8.在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10分钟，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干；

4.9.干燥后产物加入te缓冲液100ul溶解(注意产物不要过干或摆放时间过长，否则dna不易于溶解)，置4℃冰箱一周后进行浓度测定并转入-20℃冰箱保存备用。

5)通过taqman基因分型系统对候选regqtls进行基因分型

将采用taqman基因分型系统在肺癌的病例对照样本中对筛选出的regqtls进行检测，该分型系统技术成熟、位点定制自由方便、价格低廉，检测结果稳定可靠、操作方便，完全符合本发明研究需要。taqman基因分型技术的原理是利用两个等位基因特异的mgb探针和两个pcr引物，能提供高度可靠和准确的基因分型检出。两个探针的5’端标有不同的荧光(fam或vic)，3’端标有mgb不发荧光的淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的snp等位基因型。

5.1探针引物设计

以forward与reverse为引物，p-x为探针，对rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432进行基因分型的探针及引物如下：

rs7110737:forward:5’-ttgactcattttgtcatgatcctt-3’；

rs7110737:reverse:5’-tgatattgtcacccaatctgttagg-3’；

rs7110737:p-t:5’-fam-ttaggtgcatctctta-mgb-3’；

rs7110737:p-a:5’-hex-ttaggtgcatctcatatt-mgb-3’；

rs273957:forward:5’-tcagagtgacagacggaacga-3’；

rs273957:reverse:5’-cccttcaacatccatcaagaca-3’；

rs273957:p-t:5’-fam-tcgtctgtaattggct-mgb-3’；

rs273957:p-c:5’-hex-ttcgtctgtaactggct-mgb-3’；

rs6593210:forward:5’-ctacccctgctgactaactgtg-3’；

rs6593210:reverse:5’-taactgaaatctctggtccttggac-3’；

rs6593210:p-g:5’-fam-ccagcacgttcac-mgb-3’；

rs6593210:p-a:5’-hex-ccagcacattcac-mgb-3’；

rs3768617:forward:5’-caagaagctattggagggtttaaaagt-3’；

rs3768617:reverse:5’-cacctgctcccctacaatgg-3’；

rs3768617:p-g:5’-fam-tttggctttcatgttgag-mgb-3’；

rs3768617:p-a:5’-hex-tttggctttcatgttaag-mgb-3’；

rs6836432:forward:5’-catgagccaatgtctgctagctt-3’；

rs6836432:reverse:5’-cctaatccagagaaagactctagctctt-3’；

rs6836432:p-g:5’-fam-ttcctcaacatagttca-mgb-3’；

rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’。

5.2制备taqman基因分型所需试剂：正、反向引物，探针，taqman2×pcrmastermix和双蒸水。

5.3实时荧光定量pcr扩增

使用abi7500基因分型平台进行基因分型。每块96孔反应平板每孔为10ul反应体系，具体反应体系如表1。其中dna样本的浓度不低于5ng/ul。采用高透光度盖膜覆盖反应板，短暂离心以去除气泡，装入abi7500基因分型平台进行分型检测。具体反应条件如下：

95℃10min；

95℃15s，60℃1min，40个循环；

4℃∞。

扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用sds2.0软件进行基因型判读。

表1taqman基因分型反应体系

6)关联研究

通过比较观察到的基因型频率和期望频率，采用拟合度χ²检验，评价snps之间的hardy-weinberg平衡(hwe)。采用logistic回归分析来估计regqtls与肺癌发病风险之间的校正比值比(or)和95％置信区间(cis)，并对年龄、性别和吸烟数量(包/年)进行调整。接下来，将通过大样本的欧洲gwas数据分别对阳性regqtls与肺癌易感性的关联进行验证。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。

步骤一、样本的收集和资料整理

第一阶段共包含626例病例和667例健康对照。626例肺癌病例均来自2015-2017年在南通市第六人民医院、南通大学附属医院和常熟市第一人民医院明确诊断的新发肺癌病例。所有病例都经由病理组织学的证实，排除了有既往恶性肿瘤病史、其他器官转移及采血前接受过化疗或放疗的病人。667名健康对照则是从在南通接受常规健康检查的4000多名健康人群中，按照年龄(±5岁)、性别频数匹配的原则，随机抽选出来的。所有对照均是排除了有呼吸系统疾病或恶性肿瘤病史的健康对照。

第二阶段，选取了来自国际肺癌协会(ilcco)项目的18,082例病例和13,780名对照来验证第一阶段阳性regqtls与肺癌风险之间的关联。gwas研究数据均来自于欧洲人群。

步骤二、功能性regqtls的选择

由于前期研究中的regqtls主要是通过生物信息学分析得到的，其是否具有生物学功能并影响肺癌的遗传易感性有待进一步明确。为此，首先通过肿瘤基因组图谱(tcga)数据库下载肺癌相关基因(mrna)和微小rna(mirna)的表达数据以及单核苷酸多态性(snp)基因分型数据，通过通路分析等生物信息学技术预测可能通过调节mirna以影响靶基因表达的regqtl-mirna-mrna关系对，共72,314对。接着，根据p<1.0×10^-4和pfdr<0.2这两个标准对数据进行筛选，得到1,723个潜在的regqtl-mirna-mrna关系对。

接着，通过targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和mirtarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)数据库对存在相互作用的mirna-mrna进行预测，得到相互作用强的55个潜在的regqtl-mirna-mrna关系对(表2)

表2预测的55个潜在的regqtl-mirna-mrna关系对

进一步，通过gtex(https://gtexportal.org/home/testyourown)数据库进一步进行表达数量性状位点(expressionquantitativetraitloci,eqtl)分析。在此基础上，利用连锁不平衡(ld)分析(r²阈值为0.80)再次筛选这些功能性regqtls。

最后，得到了5个在肺癌中能够通过调节mirna影响靶基因表达的regqtls(图2，表3)。

表35个候选regqtls的信息

步骤三、基于中国汉族人群的第一阶段筛选

在第一阶段病例对照研究中，通过taqman基因分型系统对上述5个候选regqtls(rs7110737、rs273957、rs6593210、rs3768617和rs6836432)进行基因分型(图3)，探针及引物如下(forward与reverse为引物；p-x为探针)：

rs7110737:forward:5’-ttgactcattttgtcatgatcctt-3’；

rs7110737:reverse:5’-tgatattgtcacccaatctgttagg-3’；

rs7110737:p-t:5’-fam-ttaggtgcatctctta-mgb-3’；

rs7110737:p-a:5’-hex-ttaggtgcatctcatatt-mgb-3’；

rs273957:forward:5’-tcagagtgacagacggaacga-3’；

rs273957:reverse:5’-cccttcaacatccatcaagaca-3’；

rs273957:p-t:5’-fam-tcgtctgtaattggct-mgb-3’；

rs273957:p-c:5’-hex-ttcgtctgtaactggct-mgb-3’；

rs6593210:forward:5’-ctacccctgctgactaactgtg-3’；

rs6593210:reverse:5’-taactgaaatctctggtccttggac-3’；

rs6593210:p-g:5’-fam-ccagcacgttcac-mgb-3’；

rs6593210:p-a:5’-hex-ccagcacattcac-mgb-3’；

rs3768617:forward:5’-caagaagctattggagggtttaaaagt-3’；

rs3768617:reverse:5’-cacctgctcccctacaatgg-3’；

rs3768617:p-g:5’-fam-tttggctttcatgttgag-mgb-3’；

rs3768617:p-a:5’-hex-tttggctttcatgttaag-mgb-3’；

rs6836432:forward:5’-catgagccaatgtctgctagctt-3’；

rs6836432:reverse:5’-cctaatccagagaaagactctagctctt-3’；

rs6836432:p-g:5’-fam-ttcctcaacatagttca-mgb-3’；

rs6836432:p-a:5’-hex-aacatatttcaggcttc-mgb-3’。

将分型结果进行logistic回归分析(同时调整年龄、性别和吸烟状况)，结果显示rs3768617的突变等位基因t与肺癌发病风险增加有显著相关性(加法模型：or＝1.18，95％ci＝1.00-1.38，p＝0.044)。

步骤四、基于欧洲大样本人群的第二阶段验证

在第二阶段的病例对照研究中，对rs3768617进行了进一步分析，以验证前一阶段的结果。在欧洲gwas数据的结果中，rs3768617突变等位基因t仍然能够显著增加肺癌的发病风险(加法模型：or＝1.05，95％ci＝1.01-1.08，p＝0.007)。两阶段病例对照研究结果如表4所示。

表4rs3768617与肺癌发病风险关系的两阶段病例对照研究结果

步骤五、初步构建“regqtl-mirna-mrna”相互调控模式

采用tcga数据库评估了在rs3768617不同基因型中lamc1和mirna-548b-3p之间的表达水平。如图4所示，在rs3768617突变纯合子基因型下，lamc1和mirna-548b-3p在肺癌癌组织中的表达呈现正相关(如图4a)，而在相邻癌旁组织中的趋势恰恰相反(如图4b)，提示rs3768617不同基因型可以调节lamc1和mirna-548b-3p之间的关联，进而有可能影响肺癌的发生发展，即：阳性regqtls可作为与肺癌相关的生物标志物，用于制备肺癌辅助诊断试剂盒。

本发明的技术方案仅涉及阳性regqtls可作为与肺癌相关的生物标志物的研究，并不说明阳性regqtls可直接用于肺癌的诊断或治疗，因此，本发明所要保护的是一种与肺癌相关的外周血regqtls生物标志物的筛选和验证方法，并辅助肺癌诊断。

本发明提出一种与肺癌相关的外周血生物标志物regqtls，并辅助肺癌诊断。本发明结合了宏观上的大样本的流行病学研究方案，从人群中发现的表象进行潜在机制的探讨，从而寻找出“regqtl-mirna-mrna”相互调控模式，以期实现临床应用价值。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。