具有良好支持人诱导多能干细胞生长性能的非天然多肽的制作方法

本发明涉及两种具有比天然多肽支持人诱导多能干细胞(hipscs)生长性能更佳的非天然多肽序列。

背景技术：

2006年，takahashi和yamanaka用4个转录因子oct4、sox2、klf4和c-myc将体细胞重新编程获得了人诱导多能干细胞(hipscs)[k.takahashi,s.yamanaka,inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors,cell126(4)(2006)663-76.]。因其规避了人胚胎干细胞(hescs)的伦理道德问题且具有无限的自我更新和多向分化潜能而备受关注。传统方法中，培养在分离的滋养层细胞或matrigel上的hipscs可以获得理想的贴壁、增殖和干性维持效果[thesafetyofhumanpluripotentstemcellsinclinicaltreatment,annalsofmedicine47(5)(2015)1-11.]。遗憾的是，因存在批次间差异、含动物源性成分和易引入动物致病菌等缺点，matrigel在fipscs临床治疗中的应用受限[a.higuchi,q.-d.ling,y.-a.ko,y.chang,a.umezawa,biomaterialsforthefeeder-freecultureofhumanembryonicstemcellsandinducedpluripotentstemcells,chemicalreviews111(5)(2011)3021-3035.]。近年来，有报道指出蛋白或蛋白片段修饰的培养表面在无外源性条件下可以支持干细胞的自我更新[t.j.rowland,l.m.miller,a.j.blaschke,e.l.doss,a.j.bonham,s.t.hikita,l.v.johnson,d.o.clegg,rolesofintegrinsinhumaninducedpluripotentstemcellgrowthonmatrigelandvitronectin,stemcells&development19(8)(2010)1231-1240.；s.rodin,a.domogatskaya,s.strom,e.m.hansson,k.r.chien,j.inzunza,o.hovatta,k.tryggvason,long-termself-renewalofhumanpluripotentstemcellsonhumanrecombinantlaminin-511,natbiotechnol28(6)(2010)611-5；t.miyazaki,s.futaki,h.suemori,y.taniguchi,m.yamada,m.kawasaki,m.hayashi,h.kumagai,n.nakatsuji,k.sekiguchi,laminine8fragmentssupportefficientadhesionandexpansionofdissociatedhumanpluripotentstemcells,naturecommunications3(2012)1236；m.nagaoka,k.si-tayeb,t.akaike,s.a.duncan,cultureofhumanpluripotentstemcellsusingcompletelydefinedconditionsonarecombinante-cadherinsubstratum,bmcdevelopmentalbiology10(2010)60.]。然而，高昂的成本再次限制了它们的应用。此外，另有多种多肽序列被证实可支持hescs和hipscs的贴壁和生长。但是与matrigel相比，它们在细胞粘附和自我更新方面的性能有待进一步提高[p.zhou,f.wu,t.zhou,x.cai,s.zhang,x.zhang,q.li,y.li,y.zheng,m.wang,simpleandversatilesyntheticpolydopamine-basedsurfacesupportsreprogrammingofhumansomaticcellsandlong-termself-renewalofhumanpluripotentstemcellsunderdefinedconditions,biomaterials(2016)s0142961216001174；z.ping,y.bo,z.rui,x.zerong,l.yuqing,y.yubo,z.xiaohong,z.siqi,l.yongliang,l.huanxiang,molecularbasisforrgd-containingpeptidessupportingadhesionandself-renewalofhumanpluripotentstemcellsonsyntheticsurface,colloids&surfacesbbiointerfaces171(2018)451-460.]。因此，亟待开发一种成份明确、经济实惠且可大规模合成的表面来支持ipscs的自我更新。

2018年，本课题组基于三条已报道的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)相似结构多肽序列设计了12种新多肽，并证实了rgd周围的氨基酸序列对多肽的生物活性有巨大影响。更重要的是，实验结果提示与细胞膜表面整合素受体结合的后段序列更为重要。因此，在本研究中，我们将具有良好的支持hipscs生长性能且氨基酸序列组成相似的天然含rgd多肽—vn多肽(ac-kggpqvtrgdvftmp)和bsp多肽(ac-kggngeprgdtyray)进行rgd后段的切割和重组。首先，同时切割vn多肽和bsp多肽的rgd后段序列，将切下的vn多肽、bsp多肽的后段序列分别作为np1的后段和前段序列，获得非天然多肽序列np1(ac-kggtyrayrgdvftmp)。将切下的vn多肽、bsp多肽的后段序列分别作为np2的前段和后段序列，获得非天然多肽序列np2(ac-kggvftmprgdtyray)。然后将这些多肽分别接枝到我们先前报道的人工合成表面以评估它们在维持hipsc的粘附，自我更新和分化中的性能。最后，我们用分子动力学模拟预测了新型肽的结构模型，用石英晶体微天平(qcm)准确检测设计的多肽与整联蛋白蛋白受体之间的亲和力，并通过分子对接成功地获得了新多肽与整联蛋白αvβ3蛋白的复杂结构。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，本发明的目的是提供一种非天然多肽序列，尤其涉及一种支持hpscs生长性能的非天然多肽序列。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种支持人多能干细胞生长性能的非天然多肽及制备方法，所述支持人多能干细胞生长性能的非天然多肽序列如下：

pep1：ac-kggrgdvftmp

pep2：ac-kggrgdtyray。

作为优选的，所述制备方法为：以rgd多肽序列为基准，选择支持hpscs生长性能的bsp多肽、vn多肽和ifn多肽进行rgd前后段的切割和重组获得。

本发明与现有技术相比的优点在于：多种多肽序列被证实可支持人多能干细胞的贴壁和生长，相比之下其拥有无外源性成分、化学成分确定、经济等诸多优点，贴壁性能较好，可用于人多能干细胞的体外长期自我更新。

附图说明

图1为图1在np1和np2多肽修饰表面上培养人诱导多能干细胞hnf-c1hipscs的第四天时的贴壁情况。*示p<0.05。

图2为在np1和np2多肽修饰表面上培养的人诱导多能干细胞hnf-c1hipscs的十代内倍增时间。

图3为在np1和np2多肽修饰表面上培养的人诱导多能干细胞hnf-c1hipscs的形态。

图4为hnf-c1hipscs在np1和np2多肽修饰表面上连续培养十代后的多能性标志蛋白oct-4、ssea-3和tra-160的阳性表达率。

图5为hnf-c1hipscs在np1和np2多肽修饰表面上连续培养十代后的多能性标志基因相对表达量。

图6为多能性标志蛋白oct-4和ssea-3在np1/np2表面培养10代的人诱导多能干细胞hnf-c1hipscs细胞克隆中的表达情况。标尺：100mm。

图7为经αvβ3，αvβ5抗体封闭后的人诱导多能干细胞hnf-c1hipscs在np1和np2多肽修饰表面的黏附情况。*示p<0.05。

图8为使用石英晶体微天平测量αvβ3整合素与rgd多肽相互作用力的时间-频率曲线。

图9为hnf-c1hipscs在np2和vn多肽修饰表面及matrigel表面经过心肌分化后的基因相对表达情况。*示p<0.05。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

本发明的目的是提供一种基于天然多肽序列人工设计多肽序列的方法，尤其涉及两种具有支持hipscs生长性能的新型非天然多肽序列。

一、支持hpscs生长性能的非天然多肽序列

既往研究中，发现rgd多肽前后段氨基酸序列对其生物活性有非常重要的影响。本发明选择2条具有良好的支持hipscs生长性能且氨基酸序列组成相似的含rgd多肽—vn多肽(ac-kggpqvtrgdvftmp)和bsp多肽(ac-kggngeprgdtyray)进行rgd前后段的切割和重组，获得两条新的多肽(newpeptide，简称np)np1(ac-kggtyrayrgdvftmp)和np2(ac-kggvftmprgdtyray)。

二、非天然多肽序列支持hipscs生长性能研究

1.制备多肽修饰表面

对于设计和人工合成的2条新多肽，均在超净工作台内用无菌dpbs缓冲液配置为1mm多肽溶液，备用。

将0.2424g三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris·hcl)置入含200ml纯水的烧杯中，用滴管搅拌均匀，然后用1mol·l-1盐酸将溶液ph调为8.5，得缓冲液。将0.4g多巴胺盐酸盐粉末加入该缓冲液中，用滴管搅拌均匀。配好的多巴胺溶液，在超净工作台内经0.22μm滤膜过滤后，以每孔5ml体积加入6孔细胞培养板。置于37℃恒温摇床(70r·min-1)中过夜反应后，在超净工作台内吸尽多巴胺缓冲液，每孔加入5ml无菌纯水，超声清洗5min以去除表面物理粘附的聚多巴胺颗粒，获得聚多巴胺涂层修饰的细胞培养板。随后将24g羧甲基壳聚糖加入含800ml纯水的蓝口瓶中，利用恒温搅拌器在50℃和150r·min-1条件下过夜搅拌，获得质量分数为3％的羧甲基壳聚糖溶液，于超净工作台内用0.22μm滤膜过滤除菌。以每孔5ml体积，将无菌羧甲基壳聚糖溶液分别加入聚多巴胺修饰的6孔细胞培养板中。37℃和70r·min-1条件过夜反应后，超净台内无菌纯水冲洗3次，即获得聚多巴胺-羧甲基壳聚糖(pda-cmc)修饰的细胞培养板表面。

将19.52g吗啉乙磺酸(mes)溶于1l纯水中，用玻璃棒搅拌均匀，然后用饱和氢氧化钠溶液将ph调至5.6。将0.8gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和0.8g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)一同溶入20ml吗啉乙磺酸缓冲液中，在超净工作台内经0.22μm滤膜过滤后，以每孔3ml体积加入聚多巴胺-羧甲基壳聚糖修饰的细胞培养板中，室温反应40min，吸尽后晾干，每孔加入1mlnp1或np2多肽溶液，封口膜封闭后4℃过夜反应，得到np1/np2多肽修饰表面。

2.人诱导多能干细胞培养

人皮肤细胞来源的hnf-c1hipscs(p35)由中国科学院广州生物医药与健康研究院赠送。接种在材料之前的hnf-c1hipscs培养在预铺有1:80稀释matrigel的6孔细胞培养板中，培养基使用的是成分明确的mtesr1培养基。

3.细胞贴壁研究

图1为以单细胞和克隆团两种方式接种hipscs于多肽修饰表面，利用cck8技术检测及贴壁生长性能。培养在matrigel表面的hnf-c1hipscs，当生长至80～90％面积时用0.5mmedta消化，细胞计数后以25000细胞·cm-2密度分别接种至上述多肽修饰表面(6孔细胞培养板，pda-cmc-np1及pda-cmc-np2)，并以matrigel和vn多肽修饰表面作为对照。传代时培养基中添加5μmy-27632以促进hipscs存活，第二天更换为不含y-27632的mtesr1培养基。培养至第4天时，利用cck8细胞计数试剂盒，检测培养在多肽修饰表面和matrigel表面的细胞数。

图1的结果显示，在两种不同的消化方式下，三种表面均能支持细胞的贴壁，且np2多肽修饰表面能更好的促进hipscs贴壁生长(p＜0.05)，实现了hipscs生长至第四天的细胞量与matrigel组相当。

4.细胞倍增时间检测

选择hnf-c1hipscs细胞系，以edta消化和添加5μmrock抑制剂y-27632的形式，检测每代hipscs在np1/np2多肽修饰表面的细胞倍增时间(图2)。

图2的结果显示，在np1/np2多肽修饰表面连续培养10代过程中，细胞倍增时间结果相近，其变化范围均为25±2.98h至37±2.33h，说明这两条多肽均能很好的维持hipscs的增殖性能。

5.干性维持能力检测

hnf-c1hipscs连续传代10代后，利用体外拟胚体形成试验检测三胚层分化潜能。引物序列如下：

(1)形貌及核型分析

图3为hnf-c1hipscs在np1/np2多肽修饰表面连续传代10代后回传至matrigel表面的细胞形貌(a)，并送至北京大学医学部遗传学系进行核型分析(b)。图3示，hipscs在np1/np2多肽修饰表面连续培养10代后，均呈现典型的胚胎干细胞克隆形貌，且维持正常的染色体核型。

(2)流式细胞术

为了检测np1/np2多肽修饰表面支持hipscs的长期干性维持能力，将hnf-c1hipscs在其上进行10代连续培养实验，然后进行流式细胞术检测多能性标志蛋白oct-4、ssea-3和tra-160的阳性表达率(图4)。

图4的结果显示，oct-4在这两种表面上培养的细胞样品中的阳性表达率均超过96.0％，且另外两个多能性标志蛋白ssea-3和tra-160的阳性表达率也分别超过82.0％和97.0％。实验结果证实hipscs在np1/np2多肽修饰表面长期传代后，能够维持主要多能性标志蛋白的阳性。

(3)相关基因表达检测

利用rt-pcr实验检测相关标志基因在np1和np2多肽表面培养10代后的细胞样品中的表达(图5，其中a为np1多肽修饰表面，b为np2多肽修饰表面)。多能性标志基因oct-4和nanog在两种多肽修饰表面培养的细胞中的表达均略低于matrigel表面。同时，本发明通过体外拟胚体形成实验，进一步研究hnf-c1hipscs在np1/np2表面连续传代培养10代后的多能性维持情况。hipscs经悬浮和贴壁培养各8天后，利用q-pcr实验检测三胚层基因表达情况表达(外胚层：pax6和sox1；中胚层：t、msx1和cdh5；内胚层：afp、gata4和sox17)。

图5的结果显示，所形成的拟胚体均阳性表达三胚层基因，证实长期培养在np1和np2多肽表面的hnf-c1hipscs仍保持多向分化能力。

(4)免疫荧光分析

免疫荧光检测显示在np1/np2多肽修饰表面培养10代的hipscs系细胞克隆均高表达多能性标志蛋白oct-4和ssea-3(图6)。

上述结果说明，hipscs系在np1/np2多肽修饰表面长期传代后，能够维持正常核型和主要多能性标志蛋白的阳性表达，即np1和np2多肽修饰表面均能能够很好地支持hnf-c1hipscs的长期干性维持。

5.抗体封闭实验

利用抗体封闭实验研究np1和np2多肽的整合素作用位点，探究rgd前后段氨基酸种类改变是否引起作用位点变化。将hnf-c1细胞用0.25％胰酶/edta消化成单细胞，分别用含兔抗人整合素αvβ5亚型抗体(10μg/ml)的f12培养基(含0.35％bsa)、含兔抗人整合素αvβ3亚型抗体(10μg/ml)的f12培养基(含0.35％bsa)、含兔抗人整合素αvβ5和αvβ3亚型抗体(10μg/ml)的f12培养基(含0.35％bsa)以及不含任何抗体的f12培养基(含0.35％bsa)重悬，37℃孵育30min。细胞悬液1200rpm离心10min，弃上清，分别用mtesr1培养基重悬细胞，按照2.5×104cells/cm2密度接种到np1/np2多肽修饰表面和matrigel包被的培养板表面，在细胞培养箱中培养1h，并用cck-8测定细胞的黏附量(图7)。

图7的结果显示，np1多肽通过激活αvβ3和αvβ5两种整合素受体支持hipscs的长期干性维持，而将np1多肽首端和末端两种氨基酸调换后得到的np2多肽，主要通过激活αvβ3整合素受体支持hipscs的长期干性维持。

6.qcm实验

石英晶体微天平是一种基于石英晶体压电效应设计的，灵敏度可达纳克级的质量实时检测仪器。通过石英晶体微天平测量αvβ3整合素与rgd多肽相互作用力。以bfp多肽作为阴性对照，使用石英晶体微天平测量vn，np1，np2多肽与αvβ3整合素受体的相互作用力。具体方法如下：将纯化后的αvβ3蛋白浓度用dpbs调整至50μg/ml，通过在线模式测量vn，np1，np2多肽与αvβ3整合素受体的相互作用力，反应时间为60min(图8，图9)。图8，图9结果显示，bfp多肽反应前后的频率变化值为负，说明bfp多肽无法在与吸附αvβ3整合素的芯片发生相互作用，而vn多肽的频率变化值为41.75±9.27hz，np1多肽与np2多肽分别为23.12±5.30hz与60.61±1.29hz，说明vn多肽，np1多肽与np2多肽均可与吸附αvβ3整合素的芯片表面产生相互作用，且αvβ3整合素与np2的作用力最强，vn次之，np1最弱。因此，多肽与αvβ3整合素相互作用力大小的排序是:np2＞vn＞np1多肽，这与先前np1、np2贴壁实验的结果趋势相近，提示人多能干细胞的贴壁及干性维持的机制可能与αvβ3整合素与rgd多肽相互作用力密切相关。

在np2多肽修饰表面生长的hipscs细胞克隆融合时利用0.25％胰酶/edta消化为单细胞，然后接种至aggrewelltm800板以形成均一的拟胚体。在成分明确条件下将这些hipscs分别分化为心肌样细胞，并使用rt-pcr检测心肌相关基因的表达(图8)。方法如下：

在np2和vn多肽修饰表面以及matrigel表面的hnf-c1hipscs，在生长至约85％融合时，将培养基更换为cdm3心肌诱导分化培养基(含500μg·ml-1重组人白蛋白和213μg·ml-1抗坏血酸2-磷酸三钠盐的rpmi1640培养基。另外，在诱导开始至第2天，cdm3中添加6μmchir99021，然后更换为含有2μmwnt-c59的cdm3培养基继续诱导2天，最后换成cdm3培养基并隔天换液。诱导至第12天，收集细胞样品。pcr引物序列如下：

图9的结果显示，在np2多肽修饰表面分化后第九天形成了跳动的心肌样细胞，且这些细胞阳性表达心肌标记物myh6、tnnt2、kcnh2等。实验结果表明np2多肽修饰表面能支持hipscs在成分明确条件下定向诱导分化为心肌样细胞。

综上所述，本发明以rgd多肽序列为基准，选择具有支持hpscs生长性能的vn多肽和vb多肽进行rgd序列后段的切割和重组获得非天然多肽序列np1与np2。研究表明，两种多肽均能支持hpscs细胞的贴壁，且np2多肽修饰表面能更好的促进hipscs贴壁生长。hipscs在np1/np2多肽修饰表面连续培养10代后，均呈现典型的胚胎干细胞克隆形貌，且维持正常的染色体核型。长期培养在np1和np2多肽表面的hnf-c1hipscs仍保持多向分化能力。

实施例：

实施例1、np1的切割、重组和表达

以rgd多肽序列为基准，选择支持hpscs生长的vn多肽(ac-kggpqvtrgdvftmp)，bsp多肽(ac-kggngeprgdtyray)进行rgd后段的切割和重组。首先，同时切割vn多肽和bsp多肽的rgd后段序列，然后将切下的vn多肽、bsp多肽的后段序列分别作为np1的后段和前段序列，获得非天然多肽序列np1(ac-kggtyrayrgdvftmp)。序列合成委托杭州丹港生物科技有限公司。

实施例2、np2的切割和重组和表达

以rgd多肽序列为基准，选择支持hpscs生长的vn多肽(ac-kggpqvtrgdvftmp)，bsp多肽(ac-kggngeprgdtyray)进行rgd后段的切割和重组。首先，同时切割vn多肽和bsp多肽的rgd后段序列，然后将切下的vn多肽、bsp多肽的后段序列分别作为np2的前段和后段序列，获得非天然多肽序列np2(ac-kggvftmprgdtyray)。序列合成委托杭州丹港生物科技有限公司。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征，在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具本的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”，“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。