本发明属于生物检验检疫技术领域，具体涉及一种病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术：
新型冠状病毒肺炎(coronavirusdisease2019，covid-19)，简称新冠肺炎，是新近发现的一种正义单链线性rna病毒，属于冠状病毒β属。与之同属还包括中东呼吸综合征(mers)冠状病毒和严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒。covid-19的rna基因组包含近29000个核苷酸，编码至少27个蛋白质，其中包括15种非结构蛋白、4种结构蛋白(s、n、e和m)，以及8种辅助蛋白(3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14)。covid-19与sars-cov的核苷酸同源性高达82％，其感染宿主细胞的机制也非常相似，都是通过s蛋白与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ace2)受体结合并与宿主细胞膜融合，从而进入细胞内部。
covid-19主要通过直接传播、气溶胶传播和接触传播方式，引起患者发烧、乏力、咳嗽等呼吸道症状，病情加重后发展为呼吸困难、急性呼吸衰竭，其他一系列严重并发症，甚至死亡。地理传播之广，病例突增之迅速，致死人数之多，让全球公共卫生面临极为紧迫而巨大的挑战，造成全球社会、经济和政治空前危机。2020年3月11日，世界卫生组织将covid-19疫情评估为全球大流行(pandemic)，呼吁各国通力协作拯救生命。再此危难中，利用科学的力量控制疫情显得极为重要。
目前covid-19没有特效药，也没有疫苗。中国为了能够有效遏制疫情，采取了早检测、早隔离、早治疗，应收尽收，以及减少人际接触和跨城出行等手段，成功的快速扭转了病例增速。新加坡和韩国没有封锁城市，也成功的遏制了疫情的蔓延。在这些国家成功的背后，有一个共通的值得借鉴的关键经验，那就是检测和隔离。尽早地、大规模而快速的检测是重中之重。目前对covid-19的检验手段主要分为核酸检测法和免疫学检测法。核酸检测法是对covid-19的rna基因组进行检测，包括荧光定量pcr、基因测序、微滴式数字pcr、基因芯片测序和环介导等温扩增(lamp)等技术。免疫学检测法是对covid-19病毒抗原或人体免疫反应产生的特异性抗体进行检测，包括免疫色谱试纸条、酶联免疫吸附试验(elisa)和化学发光免疫分析(clia)等技术。虽然已有大量检测产品研发并得到推广，但在实际临床检测上不少国家仍面临着检测能力“跟不上”的困境，究其原因，主要是存在检测周期长、灵敏度低、检测工具和人力不足、检测成本高昂等缺陷。针对以上问题，本申请的发明人团队开发了一种快速检测新冠肺炎的检测技术，致力于攻克检测难关，推动临床大规模的诊断进程。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种病毒检测试剂盒及其应用。
为实现上述目的，根据本发明的第一个方面，本发明提供的病毒检测试剂盒，包括：
核酸释放剂，所述核酸释放剂包括1％sds盐溶液及蛋白酶k；
rna-cdna-rna＊反应缓冲液，所述rna-cdna-rna＊反应缓冲液包括dntps溶液，荧光ntps＊溶液，t7-ggg-covid-19特异性引物及t7反义寡核苷酸。
优选地，所述rna-cdna-rna＊缓冲液还包括镁离子。
优选地，所述rna-cdna-rna＊缓冲液还包括酶混合液，所述酶混合液包括rna逆转录酶，核糖核酸酶h及t7rna聚合酶。
优选地，所述t7-ggg-covid-19特异性引物的序列为：5′-taatacgactcactataggg-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3′，其中nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn为20碱基病毒cdna特异互补序列；
所述t7反义寡核苷酸的序列是5′taatacgactcactataggg3′的反义互补寡核苷酸序列。
根据本发明的第二个方面，本发明提出了如上所述的病毒检测试剂盒，在新型冠状病毒检测中的应用。
优选地，上述应用包括以下步骤：
将样本加入到核酸释放剂进行孵育，以得到混合溶液；
将预先连接有covid-19特异的反义寡核苷酸的n+尼龙膜放入收集容器，并在所述收集容器中加入所述混合溶液；
将rna-cdna-rna＊反应缓冲液加入至所述收集容器中，进行rna-cdna-rna＊反应；
检测所述n+尼龙膜发出的荧光信号。
优选地，所述孵育的温度为50℃至60℃，时间为5秒至15秒。
优选地，所述rna-cdna-rna＊反应的温度为35℃至40℃，时间为5至13分钟。
通过上述技术方案，本发明的病毒检测试剂盒可以用于新型冠状病毒(covid-19)的检测，并具有如下优点：其一、仅需要简单的样品温控设备和荧光检测系统，可简化原有的rt-pcr仪器需求，降低仪器成本和增加仪器便携程度，解决了检测工具方面的问题；其二、传统核酸检测包括了反转录、荧光定量扩增和检测等多重操作，耗时长，操作复杂，本技术采用恒温扩增rna＊方法，整个检测过程不到半小时，极大地提升了检测效率，解决了检测周期长的问题。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
基于新型冠状病毒(covid-19)相关检测手段，存在检测周期长、灵敏度低、检测工具和人力不足、检测成本高昂等缺陷，本申请的发明人团队开发了一种快速检测新冠肺炎的检测试剂盒，致力于攻克检测难关，推动临床大规模的诊断进程。
根据本发明实施例提供的病毒检测试剂盒，包括核酸缓释剂及rna-cdna-rna＊反应缓冲液(其中，＊指荧光)。
其中，核酸释放剂包括1％sds盐溶液(十二烷基硫酸钠)及蛋白酶k，1％sds盐溶液用于溶解样本，样本可以是咽拭子、鼻拭子和鼻咽抽取物，1％sds盐溶液的配置可以将1g的sds加入至100ml的去离子水中，即可得到1％sds盐溶液。蛋白酶k是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，用于提取样本的rna。采用上述核酸释放剂，可以确保样本能够快速释放，可以节省rna提取时间和成本，然后直接获取样本基因组rna，加速样本检测。
rna-cdna-rna＊反应缓冲液包括转录产生荧光rna＊的荧光ntps＊溶液，产生cdna的dntps溶液，t7-ggg-covid-19特异性引物及t7反义寡核苷酸，t7-ggg-covid-19特异性引物的序列5′-taatacgactcactataggg-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3′，其中nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn为20碱基病毒cdna特异互补序列。t7反义寡核苷酸即是5′taatacgactcactataggg3′的反义互补寡核苷酸，即5′ccctatagtgagtcgtatta3′。
上述rna-cdna-rna＊缓冲液还包括镁离子。
上述rna-cdna-rna＊缓冲液还包括酶混合液，所述酶混合液包括依赖于rna为模板的rna逆转录酶，核糖核酸酶h及依赖于cdna模板的t7rna聚合酶。
上所述的病毒检测试剂盒可以在新型冠状病毒检测中的应用。
具体地，上述应用包括以下步骤：
1)将样本加入到核酸释放剂进行孵育，以得到混合溶液，也即是，将样本加入至释放剂中进行快速释放，提取样本rna。较佳地，该步骤中的孵育的温度为50℃至60℃，时间为5秒至15秒。
2)将预先连接有covid-19特异的反义寡核苷酸的n+尼龙膜放入收集容器，并在所述收集容器中加入所述混合溶液。该步骤中，病毒rna将与covid-19特异的反义寡核苷酸(可能不止一个)杂交，并粘附在n+尼龙膜上进行进一步反应。
3)将rna-cdna-rna＊反应缓冲液加入至所述收集容器中进行反应。也即是，将包含镁离子，rna逆转录酶、核糖核酸酶h、荧光ntps＊溶液，dntps，t7-ggg-covid-19特异性引物、t7反义寡核苷酸及t7rna聚合酶的rna-cdna-rna＊反应缓冲液加入至收集容器中，rna-cdna-rna＊反应缓冲液与混合容器进行反应，得到rna＊反应荧光产物。
4)检测所述n+尼龙膜发出的荧光信号，也即是采用荧光检测设备检测n+尼龙膜发出的荧光信号，例如利用激光照射n+尼龙膜，采集n+尼龙膜发出的荧光信号，如果检测到强荧光信号，例如5分钟后检测到强荧光信号，则样品呈阳性，即样本中检测到新型冠状病毒，而如果未检测到荧光信号，例如15分钟后仍未检测到信号，则样本为阴性，即未检测到新型冠状病毒。
根据本发明提供的病毒检测试剂盒，可以用于新型冠状病毒(covid-19)的检测，并具有如下优点：其一、仅需要简单的样品温控设备和荧光检测系统，可简化原有的rt-pcr仪器需求，降低仪器成本和增加仪器便携程度，解决了检测工具方面的问题；其二、传统核酸检测包括了反转录、荧光定量扩增和检测等多重操作，耗时长，操作复杂，本技术采用恒温扩增方法，整个检测过程不到半小时，极大地提升了检测效率，解决了检测周期长的问题。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110>兰婷
唐贵良
<120>病毒检测试剂盒及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>29903
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>1
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