专利名称:从全发酵啤酒回收细胞外酶的方法
本发明是1985年9月4日提出的美国专利申请号775，031的继续部分。
众所周知，工业用酶的生产是采用在含水营养培养基中培养微生物的方法，例如培养细菌、真菌和酵母。根据特定微生物的性质，生产的酶(类)可能是细胞外的、细胞内的或它们的混合物。当产生的酶(类)是细胞外的，一般要得到它们首先将含酶上清液从微生物细胞中分离出来，然后用众所周知的方法，如沉淀、超滤和蒸发作用，从上清液中回收酶(类)。当产生的酶(类)是细胞内的时，首先，它们必须从细胞中脱离，这可以通过化学方法和/或机械方法来完成。一旦酶(类)放入溶液中，它们还可以采用上述已知方法进行回收。
已知细胞外酶的组分和性质是不同于细胞内酶的，例如，细胞外酶的分子量一般比细胞内酶显著地要低。含有从细胞中脱离的细胞内酶的溶液，还包含大量其它胞内物料，这些物料不存在于含有细胞外酶的全发酵啤酒中。这些不同处可以形成对于它们的回收和纯化应用不同的工艺过程，甚至当它们都在水溶液中时亦如此。显然，适宜于细胞内酶的回收工艺过程对细胞外酶是无用的。
为了改进生产和回收酶的效率和方便起见，已知可在含有聚乙醇和葡聚糖混合物的两相营养培养基中进行微生物发酵来生产酶。当发酵完成时，细胞外酶富集在面层聚乙二醇相中，而细胞和其它发酵产物富集在底层的葡聚糖相。这在《酶和微生物工程学》第7卷、333-338页(1985年)中已叙述了。在该体系中α-淀粉酶的分配系数有一个最大值，例如为4。
在美国专利4，508，825号中叙述了上述工艺过程的变化。其中，含细胞外酶上清液与细胞分离，无细胞上清液与聚乙二醇和阳离子表囟代醇/聚胺共聚物或葡聚糖聚合物混合，以形成两相。这种技术可以用来分离胞外蛋白酶和淀粉酶，其中蛋白酶富集在聚乙二醇相，淀粉酶富集在阳离子共聚物或葡聚糖相。
两相酶回收工艺过程也用于细胞内酶的回收，美国专利4，144，130号叙述了应用(1)未被取代的或取代的高分子量聚乙醇、聚醚、聚脂、聚乙烯吡咯烷酮或聚糖和无机盐的混合物，或(2)至少有两种上述高分子量聚合物的混合物，从水溶液回收细胞内酶，细胞内酶是从细胞中释放出来进入水溶液的。例如，当应用聚乙二醇和无机盐混合物时，所需细胞内酶进入面层聚乙二醇，而细胞碎片和其它发酵产物进入较低的含盐层。当处理全发酵啤酒时，在1，2-乙二醇中回收的各种酶的分配系数大约为0.3。当冻结细胞与水混合并被分离释放出酶时，分配系数约仅增加3。
美国专利4，016，039号公开了增加聚乙二醇使无机盐加速无细胞上清液中酶的沉淀。
在已有技术中没有任何迹象表明，聚乙二醇和无机盐可应用在两相方法中而从分配系数至少50的全发酵啤酒回收细胞外酶。
根据本发明提供的从全发酵啤酒回收细胞外酶的工艺过程，包括(a)选自下列种类的聚合物聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚(1，2-亚乙基二醇)酯、聚乙烯亚胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物，和(b)无机盐的混合物，加到含有微生物细胞和细胞外酶的全发酵啤酒中，全发酵啤酒-聚合物-盐混合物可以分离成富酶的聚合物相和贫酶的盐相，并从此回收富酶产品。
在上述技术中已知本发明的工艺过程用含有细胞外酶的全发酵啤酒作为原料。例如已知用地衣芽孢杆菌Amyloliquefaciens杆菌枯草杆菌和毛霉菌属miehei在适宜的营养培养基中生长，生产细胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和微生物粗制凝乳酶。在本发明的方法中可应用由细胞碎片、可溶细胞外酶和其它发酵产物形成的混合物，没有从可溶酶进一步分离细胞碎片。应用在此处的术语“细胞碎片”指的是整个细胞以及细胞片段。
然后，全发酵啤酒与聚合物和无机盐混合形成两相系。所需的细胞外酶集中在聚合物相，而细胞碎片集中在盐相。
适宜的聚合物包括聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚(1，2-亚乙基二醇)酯、聚乙烯亚胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物。最佳聚合物是聚乙二醇。可溶于含水全发酵啤酒的任何形式的聚乙二醇都是适宜的。特别有用的是分子量约3350的聚乙二醇。在室温下它是固态的。在商业生产规模上便于处理。
无机盐可以是化合物，其中阳离子是钠、钾、镁和铵，阴离子是硫酸根、碳酸根、柠檬酸根、氯根、磷酸根及其它们的混合物。最佳盐类是氯化钠和硫酸钠。
聚合物和无机盐加到全发酵啤酒，相当于组成总混合物，其中含有64-90%全发酵啤酒，1-15%聚合物和8-35%无机盐，所述百分率是根据混合物总重量的重量百分比。总混合物最好含有73-79%全发酵啤酒，3-4%聚合物和15-24%无机盐。
添加聚合物和盐之后，就形成两相。聚合物相通常在盐相的上面，两相可以通过沉降形成，两相混合物可静止放置约5小时。然后，含酶聚合物相可以由任何标准的液-液分离技术，如虹吸和倾析洗涤法进行分离以回收酶。然而，最好应用离心分离技术分离两相，有效的分离器是连续无孔转鼓离心机。为了达到所要求的分离聚合物相最终的酶浓度，富酶聚合物相对贫酶盐相的容积比最好是0.12-0.15。
为了最有效地回收细胞外酶，离心机操作应当使聚合物相中不夹带要被去除的盐相。结果是收集的聚合物相可能夹带一些混合在其中的盐相，然后，该混合物须经二次离心分离，在二次分离中，离心机操作使聚合物相中不夹带盐相，及在聚合物相中只夹带少量盐相。
如此收集的富聚合物相可以直接用作酶源。例如在聚乙二醇相中回收的碱蛋白酶在酶洗涤剂配方中是适宜的。1，2-乙二醇可以有效地作为酶的稳定剂。如果需要，可以通过人们熟知的分离技术，如沉淀、超滤或蒸发从聚合物中分离出酶，以产生基本上无聚合物的酶产品。
在本发明最佳实施例中，全发酵啤酒用1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾和0-0.6%氢氧化钙的混合物预处理，所述的百分率是根据加到发酵啤酒容积的重量计算的重量容积百分比。当聚合物和无机盐连续添加时，预处理工序帮助结絮细胞碎片和改进酶从细胞碎片的分离。当回收蛋白酶时，预处理工序最好应用1.5-5.0%氯化钙二水物和0.2-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾。当回收淀粉酶时，预处理工序应采用1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-1.0%磷酸单钠或磷酸单钾和0.1-0.6%氢氧化钙。
在该技术中，已知分配系数作为分离效率的测定，分配系数表示为面层或聚合物相的酶活性浓度除以底层或无机盐相的酶活性浓度。每一相的酶活性可以通过已知技术测定。本发明工艺过程可以达到的分配系数至少为50，超过已知的现有技术，体现出显著的进展。
下列实施例进一步详细叙述本发明。
实施例1通过把下列组分加到6000加仑(22712升)发酵器制备适宜于生产碱蛋白酶的营养培养基麦谷蛋白 1500磅(681公斤)柠檬酸钠 165磅(74.9公斤)氯化钙二水物 165磅(74.9公斤)玉米淀粉 5000磅(2270公斤)大豆粉 2500磅(1135公斤)热稳定α淀粉酶 5磅(2.27公斤)磷酸单钠 400磅(181.6公斤)磷酸二钠 400磅(181.6公斤)防泡沫剂 16.5加仑(62.5升)水 加至6000加仑(22712升)然后，该培养基用地衣芽孢杆菌活细胞接种，并且可以在36℃下发酵36小时。为了形成全发酵啤酒，添加214加仑(811升)70%(重量/容积)氯化钙二水物水溶液和300磅(136公斤)磷酸单钠。根据每种添加物的重量和发酵啤酒的容积，结果生成一种混合物，含有2.5%(重量/容积)氯化钙二水物和0.6%(重量/容积)磷酸单钠。当混合加入氢氧化钠的添加物时，混合物的PH值保持在6.8-7.6，完成混合以后，加入氢氧化钠调节PH值至7.4-7.6以完成结絮。然后，加入50%(重量百分比)乙酸水溶液，使PH值调节到6.4-6.6。为了得到最后的混合物，在25-27℃下添加11600磅(5260公斤)氯化钠，并且搅拌混合物达一小时，以至完全溶解氯化钠。接着添加3100磅(1400公斤)分子量为3350的聚乙二醇和4250磅(1930公斤)硫酸钠，增加啤酒温度至30-32℃，啤酒的PH值通过加入乙酸溶液而调节至6.0-6.2，并搅动总混合物2小时。总混合物含有15%(重量百分比)氯化钠、4%(重量百分比)聚乙二醇、5.5%(重量百分比)硫酸钠和75.5%(重量百分比)全发酵啤酒。该百分率是按添加物的重量对发酵啤酒和添加物的总混合物重量之比而计算的。混合以后，总混合物分离成面层乙二醇相和底层的氯化钠硫酸钠-细胞碎片相，面层相容积对底层相容积的相比是0.15。面层相蛋白酶活性浓度除以底层相蛋白酶活性浓度的分配系数为60-80。然后使用连续无孔转鼓离心机分离两个相，调节离心机使达到基本分离，在要被去除的盐相中不夹带聚乙二醇相。1，2-乙二醇相含有90-92%发酵啤酒的总的酶活度，1，2-乙二醇相还含有约5-20%(容积百分比)盐相夹带。此后，上述内集的1，2-乙二醇相用类似的设备经进行二次分离，其中选定的操作参数以便在1，2-乙二醇相中允许夹带的盐相少于2%(容积百分比)，盐相被去除了，并且不含有1，2-乙二醇相。再把上述收集的1，2-乙二醇相放入10℃的冷却槽，以排除少量硫酸钠。添加少量硫酸钠晶体诱导硫酸钠晶体的生长，在10℃下经适度搅拌2小时后，排出无硫酸钠的1，2-乙二醇相，它与活性炭和助滤剂混和后，用压滤机过滤，结果使富碱蛋白酶1，2-乙二醇溶液可以直接用于液态酶洗涤剂配方。
实施例2通过添加氯化钙二水物和磷酸单钠的工序重复实施例1的生产过程。使全发酵啤酒-添加物混合物与2130磅(970公斤)分子量3350的聚乙二醇和10660磅(4850公斤)硫酸钠混和，啤酒温度上升到30-32℃。然后，将含有3%(重量百分比)聚乙二醇、15%(重量百分比)硫酸钠和82%(重量百分比)全发酵啤酒的总混合物搅拌1小时。混和后，总混合物分离成面层聚乙二醇相和底层硫酸钠-细胞碎片相，面层相容积对底层相容积的相比是0.12，面层相蛋白酶活性浓度除以底层相蛋白酶活性浓度，结果是分配系数为60-80。在1，2-乙二醇相的碱蛋白酶处于无定形固态，如实施例1所述，用离心机分离两个相，以产生含有无定形固态蛋白酶的1，2-乙二醇相和少于2%(体积百分比)的盐相夹带量。然后，通过离心分离方法回收固体，它们可在颗粒酶洗涤剂产品中用作颗粒蛋白酶。
实施例3通过把下列组分加到6000加仑(22712升)发酵器，制备适宜于生产热稳定α-淀粉酶的营养培养基氯化钙二水物 22.5磅(10.2公斤)磷酸单钾 300磅(136.2公斤)磷酸二钾 700磅(317.8公斤)硫酸铵 250磅(113.5公斤)柠檬酸钠 100磅(45.4公斤)玉米浆 1000磅(434公斤)乳糖 7000磅(3178公斤)棉籽粉 1500磅(618公斤)大豆粉 2000磅(908公斤)防泡沫剂 165加仑(625升)水 加至6000加仑(22712升)然后，该培养基用地衣芽孢杆菌活细胞接种，可以在42℃下发酵108-110小时，通过定时添加氢氧化钠，保持PH值为7.05-7.15。为了最后得到全发酵啤酒，添加343加仑(1300升)70%(重量容积百分比)氯化钙二水物水溶液、240加仑(908升)10%(重量容器百分比)氢氧化钙水溶液和60磅(27公斤)磷酸单钾。根据每种添加物的重量和发酵啤酒的容积，结果生成一种混合物，含有4%(重量容积百分比)氯化钙二水物、0.4%(重量容积百分比)氢氧化钙和0.12%(重量容积百分比)磷酸单钾。当混和加入氢氧化钠的添加物时，混合物的PH值保持在7.6-8.4完成混合以后，添加氢氧化钠使PH值调节至8.4-8.6。为了得到最后的混合物，在25-27℃下添加2600磅(1180公斤)分子量为3350的聚乙二醇和7420磅(3370公斤)氯化钠，并且搅拌混合物至少达一小时。然后，添加5940磅(2700公斤)硫酸钠，加热发酵啤酒混合物至30-32℃。添加氢氧化钠使PH值调整到7.9-8.1，并且搅拌总混合物至少达2小时。总混合物含有3.5%(重量百分比)聚乙二醇、10%(重量百分比)氯化钠、8%(重量百分比)硫酸钠和78.5%(重量百分比)全发酵啤酒。混合以后，总混合物分离成面层聚乙二醇相和底层的氯化钠-硫酸钠-细胞碎片相，面层相容积对底层相容积的相比是0.12。面层相淀粉酶活性浓度除以底层相淀粉酶活性浓度，其结果是分配系数为50-70。如实施例1所述，应用连续无孔转鼓离心机回收富淀粉酶1，2-乙二醇相，然后，如实施例1所述纯化富淀粉酶1，2-乙二醇相，以生产一种富淀粉酶1，2-乙二醇产品。
实施例4通过把下列组分加到6000加仑(22712升)发酵器制备适宜于生产α-淀粉酶的营养培养基碳酸钙 530磅(240.6公斤)鱼粉 750磅(340.5公斤)精磨大豆粉 2800磅(1271公斤)玉米浆 1500磅(681公斤)乳糖 7000磅(3178公斤)磷酸二铵 130磅(59公斤)防泡沫剂 40加仑(151.4升)水 加至6000加仑(22712升)然后，该培养基用Amyloliquefaciens杆菌的活细胞接种，并且可以在34℃下发酵60小时，定时添加氢氧化钠，保持PH值为7.05-7.15。为了最后得到全发酵啤酒，添加257加仑(973升)70%(重量容积百分比)氯比钙二水物水溶液、180加仑(681升)10%(重量容积百分比)氢氧化钙水溶液和300磅(136公斤)磷酸单钾。根据每种添加物的重量和发酵啤酒的容程。结果生成一种混合物，含有3%(重量容积百分比)氯化钙二水物、0.3%(重量容积百分比)氢氧化钙和0.6%(重量容积百分比)磷酸单钾。当混合加入氢氧化钠的添加物时，混合物的PH值保持在6.8-7.6。完成混合以后，添加氢氧化钠使PH值调节至7.4-7.6。为了得到最后的混合物，在25-27℃下添加2510磅(1140公斤)分子量为3350的聚乙二醇和7960磅(3600公斤)氯化钠，并且搅拌混合物至少达一小时。然后，添加10700磅(4870公斤)硫酸钠，加热发酵啤酒混合物至30-32℃，添加氢氧化钠使PH值调节至7.4-7.6，搅拌总混合物至少达2小时。总混合物含有3.15%(重量百分比)聚乙二醇、10%(重量百分比)氯化钠、13.5%(重量百分比)硫酸钠和73.35%(重量百分比)全发酵啤酒。混合以后，总混合物分离成如实施例3所述的两个相，具有相比0.12及分配系数为50～70，如其中所述的处理两个相，以生产一种富淀粉酶1，2-乙醇产品。
权利要求
1.一种从全发酵啤酒回收细胞外酶的方法，其中包括(a)选自下列种类的聚合物聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸盐衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸盐衍生物、聚(1，2-亚乙基二醇)酯、聚乙烯亚胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的混合物，与(b)无机盐组成的混合物，加到含有微生物细胞和细胞外酶的全发酵啤酒中，全发酵啤酒-聚合物-盐混合物可以分离成富酶聚合物相和贫酶盐相，并从此回收富酶产品。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中无机盐选自化合物类，其中阳离子是钠、钾、镁和铵，阴离子是硫酸根、碳酸根、柠檬酸根、氯根、磷酸根及它们的混合物。
3.根据权利要求
1所述的方法，其中全发酵啤酒、聚合物和无机盐的总混合物含有64-90%全发酵啤酒，1-15%聚合物和8-35%无机盐，所述百分率是根据混合物总重量的重量百分比。
4.根据权利要求
1所述的方法，其中全发酵啤酒、聚合物和无机盐的总混合物含有73-79%全发酵啤酒，3-4%聚合物和15-24%无机盐，所述百分率是根据混合物总重量的重量百分比。
5.根据权利要求
4所述的方法，其中聚合物是聚乙二醇，无机盐是氯化钠和硫酸钠的混合物。
6.根据权利要求
4所述的方法，其中聚合物是聚乙二醇，盐是硫酸钠。
7.根据权利要求
4所述的方法，其中聚合物是具有分子量约为3350的聚乙二醇。
8.根据权利要求
4所述的方法，其中在添加聚合物和无机盐混合物之前，全发酵啤酒与1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾和0-0.6%氢氧化钙的混合物接触，所述的百分率是根据加到发酵啤酒容积的重量计算的重量容积百分比。
9.根据权利要求
8所述的方法，其中全发酵啤酒与1.5-5.0%氯化钙二水物和0.2-1.2%磷酸单钠或磷酸单钾的混合物接触。
10.根据权利要求
8所述的方法，其中全发酵啤酒与1.5-5.0%氯化钙二水物、0.1-0.6%氢氧化钙和0.1-1.0%磷酸单钠或磷酸单钾的混合物接触。
11.根据权利要求
4所述的方法，其中富酶聚合物相对贫酶盐相的容积比是0.12-0.15。
12.根据权利要求
4所述的方法，其中结果形成的两个相用连续无孔转鼓离心机进行分离。
13.一种细胞外碱蛋白酶的回收方法，其中包括在适当的营养培养基中发酵适宜的地衣芽孢杆菌菌种，以产生含有地衣芽孢杆菌细胞和细胞外碱蛋白酶的全发酵啤酒，加入所述全发酵啤酒中2.5%氯化钙二水物，0.6%磷酸单钠或磷酸单钾，上述百分率是根据添加物的重量对发酵啤酒的容积计算的重量容积百分比，加入上述混合物中3%聚乙二醇和15%硫酸钠，所述百分率是根据发酵啤酒和添加物的总混合物重量的重量百分比，形成一种富碱蛋白酶聚乙二醇相和一种贫碱蛋白酶硫酸钠相，并且由此分离两相以回收富碱蛋白酶产品。
14.根据权利要求
13所述的方法，其中添加氯化钙二水物和磷酸单钠或磷酸单钾之后，该混合物与15%氯化钠，4%聚乙二醇和5.5%硫酸钠接触，所述百分率是根据发酵啤酒和添加物的总混合物重量的重量百分比。
15.一种细胞外热稳定α-淀粉酶的回收方法，其中包括在适当的营养培养基中发酵适宜的地衣芽孢杆菌菌种，以产生含有地衣芽孢杆菌细胞和细胞外α-淀粉酶的全发酵啤酒，加入所述全发酵啤酒中0.4%氢氧化钙、0.12%磷酸单钠或磷酸单钾和4%氯化钙二水物，所述百分率是根据添加物的重量对发酵啤酒的容积计算的重量容积百分比，加入上述混合物中3.5%聚乙二醇、10%氯化钠和8%硫酸钠，所述百分率是根据发酵啤酒和添加物的总混合物重量的重量百分比，形成一种富淀粉酶聚乙二醇相和一种贫淀粉酶氯化钠-硫酸钠相，并且由此分离两相以回收富淀粉酶产品。
16.一种细胞外α-淀粉酶的回收方法，其中包括在适当的营养培养基中发酵适宜的Amyloliquefaciens杆菌菌种，以产生含有Amyloliquefaciens杆菌细胞和细胞外α-淀粉酶的全发酵啤酒，加入所述全发酵啤酒中3%氯化钙二水物、0.3%氢氧化钙和0.6%磷酸单钠或磷酸单钾，所述百分率是根据添加物的重量对发酵啤酒的容积计算的重量容积百分比，加入上述混合物3.15%聚乙二醇、10%氯化钠和13.5%硫酸钠，所述百分率是根据发酵啤酒和添加物的总混合物重量的重量百分比，形成一种富淀酶聚乙二醇相和一种贫淀粉酶氨化钠-硫酸钠相，并且由此分离两个相以生产富淀粉酶产品。
专利摘要
采用把聚合物与无机盐的混合物加入啤酒的方法，可以从全发酵啤酒回收细胞外酶。该总混合物产生一种富酶聚合物相和含有细胞碎片、贫酶盐相，可以分离两相，从聚合物相产生富酶产品。
文档编号C12N9/56GK86106017SQ86106017
公开日1987年4月8日 申请日期1986年9月3日
发明者杰克·威廉·布鲁尔, 查尔斯·埃弗雷特·布拉泽斯, 特里·弗雷德·法弗金宗烈, 李恩圭 申请人:迈尔斯实验室公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan