一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组基因表达系统，具体而言，本发明涉及在细胞内稳定表达人工改造后，具有核定位信号的人巨细胞病毒pp65基因及其应用。
【背景技术】
[0002]人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)在人群中的感染极为普遍,呈世界性分布，国内约90%成人可检出HCMV抗体。已知人类的HCMV初次感染(又称原发感染)通常发生在2岁以内，且一旦感染，病毒难以被清除体外，大多终身潜伏于宿主机体中。在免疫功能正常的人群，该病毒与宿主处于“平衡”状态，当机体由于各种原因导致免疫力低下时(HIV感染、移植和衰老等)，这种“平衡”就会被打破引起HCMV再激活感染，此时的病毒可以来自宿主本身也可以来源于其他感染者。原发感染和再激活感染统称活动性感染，AIDS患者、移植受者和老年人中，HCMV活动性感染可引起多种疾病，甚至导致死亡；在免疫功能尚未发育成熟的胎儿则有致畸性，导致出生缺陷。
[0003]目前还没有可预防HCMV感染的疫苗，但临床研究已发现，早期抗病毒治疗可以减轻先天性感染儿童神经系统损伤，挽救听力；可以降低移植患者病死率、避免过度免疫抑制治疗；并可预防艾滋病患者视网膜病变，有助于提高患者的生活质量。因此，临床急需快速、准确的HCMV活动性感染检测手段。常规病毒分离培养虽是HCMV诊断的“金标准”，但需4周才能获阳性结果，难以满足快速诊断的要求。ELISA法检测HCMV特异性IgM抗体可用于免疫功能正常的HCMV活动性感染或HCMV病的诊断，但其阳性率低，在严重免疫抑制患者还可因缺乏抗体反应或抗体延迟出现而“误诊”。HCMV pp65为被膜蛋白，位于该病毒的衣壳和其包膜之间，属于低基质磷酸化蛋白，分子量为65kD,占病毒总蛋白的15%,是激发机体细胞免疫的主要病毒蛋白。由于HCMV主要潜伏于人外周血单个核细胞，发生再激活感染时，病毒首先在单个核细胞中复制增殖，再随血流播散引起体液免疫反应。因此，单个核细胞中PP65抗原出现的时间较特异性IgM抗体出现早，且不会因为患者免疫功能低下而表达降低。同时检测出PP65抗原血症不仅可以说明存在HCMV再激活感染，也可以说患者缺失针对HCMV的细胞免疫力。因此，通过检测患者HCMV pp65抗原血症是新近被临床广泛接受的检测HCMV活动性感染的“新金标准”。鉴于此，建立pp65抗原血症检测试剂盒将会有效帮助临床解决HCMV活动性感染诊断问题。
[0004]然而作为临床诊断使用的HCMV pp65抗原血症检测试剂盒需要准确可靠的阳性对照，HCMV在体外难以感染单核细胞，因此不能采用体外感单核细胞染细胞的方式制备阳性对照；在大多数患者体内HCMV pp65抗原血症阳性的细胞数目较少(小于1%)，因此直接以已知阳性患者的单核细胞作为阳性对照也难以实现；若将PP65基因直接转染细胞，pp65蛋白会表达与细胞浆中，这与HCMV感染时pp65表达与细胞核中存在明显差异，因此也不能作为对照。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是建立核内稳定表达HCMV pp65基因的K562细胞，用作HCMV pp65抗原血症检测试剂盒阳性对照。
[0006]本发明的目的是通过以下方案实现的:
一种核内稳定表达人巨细胞病毒PP65蛋白K562细胞株的制备方法:包括以下步骤:
a)采用套叠PCR获取3_’端增加核定位信号的人巨细胞病毒pp65基因；
b)将该基因克隆至慢病毒表达载体PLVX-puro中，并包装表达pp65_NLS基因的慢病毒；
c)用表达PP65-NLS基因的慢病毒感染K562细胞；采用嘌呤霉素筛选出稳定表达PP65-NLS基因的K562细胞株。
[0007]所述的一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法，其特征在于:PP65-NLS基因是通过套叠PCR在正常人巨细胞病毒pp65基因3_’端增加核定位信号NLS。
[0008]所述的一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法，其特征在于:核定位信号的氨基酸残基序列为DPKKKRKVDroPKKKRKVDPKRKVGSTGSRGT。
[0009]所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法，其特征在于:其中PP65基因表达在细胞核中，与人巨细胞病毒感染细胞时pp65蛋白在受感染细胞中的定位一致，而与直接转染PP65基因只会表达在细胞浆中不同。
[0010]所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法，其特征在于:
制备方法包括以下步骤:
(O制备3’端连接核定位信号的pp65基因
根据Genebank中已公布的HCMVAD169株基因序列，确定HCMV pp 65基因编码序列，设计用于扩增HCMV pp 65的PCR引物，以HCMV AD169 DNA为模板，通过三轮套叠PCR，获得3 ’端携带核定位信号的pp65基因，连接至PLVX-Puro质粒，构建重组质粒PLVX-Puro-pp65-NLS,转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒，通过DNA测序获得序列正确的重组载体；
(2)慢病毒包装
将序列正确的重组载体PLVX-Puro-pp65-NLS质粒与慢病毒包装质粒PSP和AG，按2:3:3的比例混合，转染至293FT细胞，48h后收集细胞培养上清，通过ELISA法检测p24蛋白浓度判定包装好的慢病毒液滴度，根据测定的慢病毒滴度，如果滴度未达到107PFU/ml，则通过超速离心将慢病毒浓缩至滴度达107PFU/ml以上；
(3 )、慢病毒感染及抗性细胞筛选
将慢病毒液按MOI=1感染K562细胞，用含2 μ g/ml嘌呤霉素的完全培养基持续培养7日，筛选出具有嘌呤霉素抗性的细胞；
(4)、克隆化培养
将具有嘌呤霉素抗性的K562细胞通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆，挑取单个克隆扩大培养，并用间接免疫荧光观察，选择细胞核内表达PP65的细胞。
[0011]所述核内稳定表达人巨细胞病毒PP65蛋白K562细胞株的应用，其特征在于:其可用做人巨细胞病毒抗原血症检测的阳性对照品。
[0012]本发明有益效果为:
本发明建立的核内稳定表达PP65蛋白的K562细胞具有与HCMV感染时pp65在宿主细胞中的定位一致，适合规模化生产的特点。
[0013]本发明在HCMV pp65基因的3’端增加了核定位信号，使得转染该基因的细胞核内表达PP65基因，与HCMV感染宿主细胞时的细胞定位一样。再包装表达HCMV pp65_NLS基因的慢病毒，感染K562细胞，筛选出稳定在核内表达pp65蛋白的克隆，以此作为HCMV pp65抗原血症检测试剂盒的阳性对照。该阳性对照主要有以下特点:1.PP65蛋白表达与细胞核内，与HCMV感染时pp65在宿主细胞中的定位一致；2.省去了病毒感染或质粒转染等较繁琐的操作，只需要培养细胞即可，更适应大规模生产。
【附图说明】
[0014]图1为间接免疫荧光检测pp65-NLS在K562细胞中的表达；
其中，A:转染HCMV pp65基因的K562细胞DAPI染色(显示细胞核);B:转染HCMV pp65基因的K562细胞pp65单克隆抗体染色(显示pp65主要表达在细胞浆);C:稳定表达增加核定位信号的HCMV pp65基因(pp65-NLS)的K562细胞DAPI染色(显示细胞核);D:稳定表达PP65-NLS的K562细胞pp65单克隆抗体染色(显示pp65主要表达在细胞核)。
【具体实施方式】
[0015]实施例1、
所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法，其特征在于:
制备方法包括以下步骤:
(O制备3’端连接核定位信号的pp65基因
根据Genebank中已公布的HCMVAD169株基因序列，确定HCMV pp 65基因编码序列，设计用于扩增HCMV pp 65的PCR引物，以HCMV AD169 DNA为模板，通过三轮套叠PCR，获得3 ’端携带核定位信号的pp65基因，连接至PLVX-Puro质粒，构建重组质粒PLVX-Puro-pp65-NLS,转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒，通过DNA测序获得序列正确的重组载体；
(2)慢病毒包装
将序列正确的重组载体PLVX-Puro-pp65-NLS质粒与慢病毒包装质粒PSP和AG，按2:3:3的比例混合，转染至293FT细胞，48h后收集细胞培养上清，通过ELISA法检测p24蛋白浓度判定包装好的慢病毒液滴度，根据测定的慢病毒滴度，如果滴度未达到107PFU/ml，则通过超速离心将慢病毒浓缩至滴度达107PFU/ml以上。
[0016]( 3 )、慢病毒感染及抗性细胞筛选
将慢病毒液按MOI=1感染K562细胞，用含2 μ g/ml嘌呤霉素的完全培养基持续培养7日，筛选出具有嘌呤霉素抗性的细胞；
(4)、克隆化培养
将具有嘌呤霉素抗性的细胞通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆，挑取单个克隆扩大培养，并用间接免疫荧光鉴定PP65蛋白的表达及细胞定位，即得。
[0017]实施例2
(O构建3’端含核定位信号的pp65基因
1)根据Genebank中已公布的HCMVAD