提取和纯化贝酵母DNA:
在YPD培养基中分别培养非耐硫葡萄汁酵母菌株ACY338、A4，以扩增其细胞，收集细胞于离心管，使细胞破碎，释放内含物，使DNA与蛋白质等分离，收集DNA。
[0023]其中，Yro培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基。
[0024]以上步骤(I)对所收集的DNA可以进一步置放在Agrose胶上电泳，以紫外检测仪与标准分子量相比较估算被测DNA的分子量和浓度。
[0025](2)构建葡萄汁酵母SSUl基因表达载体: 以耐硫菌株A9的DNA为模板，扩增SSUl基因，引物为 L1: GCA GGA TCC GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T ；
Rl: CAG GTC GAC AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC。
[0026]注:引物下划线部分分别为BanR I的酶切位点和Sal I的酶切位点。
[0027]用BanR I和Sal I对PCR产物进行酶切，产物与同样经BanR I和Sal I双酶切的表达载体YEp352连接，成功构建重组质粒(图2)。用电击转化至大肠杆菌DH5 α中，构建含葡萄汁酵母SSUl基因的表达载体，即转化子I。
[0028]进一步，将以上步骤(2)用PCR扩增目标基因及测序方法验证转化子I。
[0029](3)葡萄汁酵母转基因:
将感受态葡萄汁酵母细胞与重组质粒在电击杯中按体积比10:1混匀后电击，再室温静置，加入少量YEP培养液，28°C静置Ih，然后28 V，200rpm培养2h，含硫的YPD培养基平板上挑选转化子2。其中，YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，pH为7.0的液体培养基。
[0030](4)葡萄汁酵母菌株及转化子耐硫性测定:
将不同菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上，该YPD培养基的pH3.5，且含琥珀酸盐，在该YPD培养基上能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株。
[0031]此外，转化子2能在耐硫培养基上正常生长，且能在灭菌后的含硫葡萄汁中正常发酵，与优良酿酒酵母菌株ECl 118及耐硫葡萄汁酵母菌株A9的发酵能力相差无几，而非转化子则无法正常生长或正常发酵(如图4、5)。
[0032]二、转SSUl基因提升葡萄汁酵母耐硫菌株能力的鉴定方法 1、以PCR扩增目标基因验证转化子2鉴定葡萄汁酵母耐硫菌株
从不耐硫葡萄汁酵母菌株ACY330和A4转SSUl基因后代中，在含15 mg/L亚硫酸钠的培养基上各随机挑选5个转化子2，共计10个候选转化子2进行PCR分析。步骤还包括:
(I)组成PCR反应体系(单位:微升)配方:
2.5 微升 10XPCR buffer (包含 Mg2+)，
I微升的10 mM前导链引物
I微升的10 mM后导链引物
0.5 微升的 10 mM 10 mM dGTP、dATP、dCTP 和 dCTP
0.2微升的5U/ μ L Taq DNA聚合酶
2微升模板DNA
17.8 微升 dH20
上述PCR反应体系以55Z//为基因扩增引物:L1: GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T ；Rl:AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC。
[0033](2) PCR 反应程序:
①95°C 5分钟 '②95°C解链30钞54°C退火30秒72°C延伸60秒②-④35个循环；⑥72°C延伸7分钟。
[0034](3) PCR产物用凝胶成像系统观察结果:
经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5 μ g 的溴化乙锭，电压为3?5 V/cm，照像记录； (4)PCR产物测序:
获得的序列用Vector NTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对。
[0035]葡萄汁酵母菌株及转化子的SSUl基因PCR鉴定结果:10个候选转化子2均含有转基因特征带，且只产生一条大小为1712bp的条带，非转化子不能产生特征条带(见图3)。
[0036]2、以灭菌后含硫葡萄汁小规模发酵试验鉴定葡萄汁酵母耐硫菌株
在50mL的锥形瓶中加入30mL的DMDC灭菌全汁葡萄汁，并按15mg/L加入亚硫酸钠；再在每毫升葡萄汁中加入2.5X 16个葡萄汁酵母细胞；温度设置为30°C，摇床转速为100rpm ;发酵进程通过每24小时测量一次其减轻的重量而进行监测；设置一个不加任何酵母细胞的空白对照，及一个加酿酒酵母ECl118细胞的对照。上述DMDC为3，3- 二甲基-4，4- 二氨基二环己基甲烷，终浓度为200mg/L。各菌株在含硫葡萄汁中小规模发酵的结果如图5所不O
【主权项】
1.转SSUl基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法，包括以下步骤: (1)在Yro培养基中培养葡萄汁酵母以扩增细胞，收集该细胞于离心管后破碎，释放内含物，收集DNA ； 所述Yro培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基； (2)构建葡萄汁酵母SSUl基因表达载体: 以耐硫菌株A9的DNA为模板，扩增SSUl基因，引物为L1: GCA GGA TCC GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T ；Rl: CAG GTC GAC AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC。
2.用及?H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物下划线部分为Bern H I的酶切位点和Sal I的酶切位点，其产物与同样经Bern H I和Sal I双酶切的表达载体YEp352连接，构建重组质粒，再将重组质粒电击转化至大肠杆菌DH5a中成为转化子I ; (3)目的基因转化葡萄汁酵母: 制备葡萄汁酵母感受态细胞；在1^培养基中扩大培养转化子1，提取重组质粒；将感受态葡萄汁酵母细胞与重组质粒按体积比(8?10):1混匀于电击杯中电击，室温静置后加入少量YEP培养液，28°C静置lh，然后28°C，200rpm培养2h，构建成为目的基因转化葡萄汁酵母的转化子2，即葡萄汁酵母感受态细胞； 所述LB培养基是含胰化蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl 10g/L的液体培养基；YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，PH为7.0的液体培养基； (4)培养葡萄汁酵母耐硫菌株: 将步骤(3)的转化子2和葡萄汁酵母菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上培养葡萄汁酵母耐硫菌株，该YPD培养基的pH3.5，且含80mM琥珀酸盐。
3.根据权利要求1所述的提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法，其特征是:将步骤(I)所收集的葡萄汁酵母DNA在Agrose胶上电泳，通过紫外检测估算被测葡萄汁酵母DNA的分子量和浓度。
4.根据权利要求1所述的提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法，其特征是:随机挑选步骤(2)的大肠杆菌DH5a转化子进行PCR分析，测序验证转化子I。
5.如权利要求1?3所述的转SSUl基因提升葡萄汁酵母耐硫菌株能力之一种的鉴定方法，其特征是:随机挑选步骤(3)接种于YPD培养基上的目的基因转化葡萄汁酵母的转化子2，以SSUl为基因扩增引物组成PCR反应体系，经反应分析鉴定PCR产物；鉴定结果:转化子2只产生一条大小为1712bp的条带；而非转化子不能产生特征条带。
6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征进一步是:在50mL的锥形瓶中加入30mL的DMDC灭菌且含15mg/L亚硫酸钠的全汁葡萄汁，再按每毫升葡萄汁中加入步骤(4)葡萄汁酵母耐硫菌株的2.5 X 16个细胞，在温度30°C，摇床转速为100 rpm发酵；鉴定结果:转化子2能在灭菌后的含硫葡萄汁中正常发酵，而非转化子则无法正常发酵； 上述DMDC为3，3- 二甲基-4，4- 二氨基二环己基甲烷，终浓度为200mg/L。
【专利摘要】转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法及鉴定方法，属于培育酵母新菌株的方法。本发明包括：提取和纯化葡萄汁酵母DNA：构建SSU1基因表达载体；葡萄汁酵母转基因；葡萄汁酵母菌株耐硫性测定；PCR筛选转化子；PCR产物测序：灭菌后的含硫葡萄汁发酵试验等。测序表明：候选转化子中均含有转基因特征序列。试验表明：转化子ACY330-SSU1和A4-SSU1均能在含15mg/L亚硫酸钠的基质中很好的发酵。本发明获得了葡萄汁酵母耐硫转基因后代菌株，转化子菌株鉴定的准确率极高。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12N15-81
【公开号】CN104711284
【申请号】CN201510108971
【发明人】张汉尧, 刘小珍, 张智铭, 贺笑
【申请人】西南林业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月13日