一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
【专利说明】一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
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技术领域
[0002]本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种极耐热α -鼠李糖苷酶及其制备方法和应用。
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【背景技术】
[0004]α -鼠李糖苷酶(a -L-Rhamnosidase)是一种可以水解多种天然化合物糖基末端并释放鼠李糖的糖苷水解酶，包括橙皮苷、芦丁、槲皮苷、柚皮苷及一些萜烯类糖苷等天然化合物。由于α-鼠李糖苷酶广泛地催化多种底物，使得其在众多领域被广泛应用，例如转化柚皮苷、橙皮苷等使其苦味降低，从而改善果汁的口味；转化芦丁生成生物利用度更高、在抑制恶性肿瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2等方面生物活性更强的异槲皮素；转化人参皂苷Re、Rg2等生成稀有且活性更强的人参皂苷Rgl、Rhl等。这些使得α -鼠李糖苷酶在食品、医药领域具有广泛应用的潜力。
[0005]α -鼠李糖苷酶早在1938年即被分离鉴定，经过多年的研宄目前已有3000多种不同来源的α-鼠李糖苷酶被分离鉴定、克隆表达，但是至目前为止还没有用于商业化的纯的α-鼠李糖苷酶。仅有两种分别来源于黑曲霉和青霉菌来源的菌株被用于商业化制备富含α-鼠李糖苷酶的酶制剂。我们分析了已有的研宄，发现其中存在的问题与局限性，并进行了总结:(I)真菌产α-鼠李糖苷酶大多是发酵后的粗酶液，其中不仅含有α-鼠李糖苷酶还有大量的β —葡萄糖苷酶等其它糖苷水解酶，在使用过程中无法避免的产生副产物而降低目的产物得率。⑵目前报道的大部分α-鼠李糖苷酶活力较低，无法适用于规模化的生产，同时真菌发酵产酶过程中影响因素较多不利于生产调控。(3)目前绝大部分不同来源的α -鼠李糖苷酶普遍为中温酶，反应温度不高，当需要提高催化体系温度转化一些溶解度不高的原料时，大部分酶无法在高温条件下保持较高的热稳定性，影响生产效率。
[0006]综合考虑上述问题，申请人认为发掘耐热α -鼠李糖苷酶基因，并通过基因工程手段得到基因重组菌，优化表达条件从而较高地表达高温型α -鼠李糖苷酶可能是有效的解决途径。
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【发明内容】
[0008]解决的技术问题:本发明针对上述局限性，提供一种改良的α -鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，并通过基因工程技术获得催化性能稳定，成分单一的新型重组α -鼠李糖苷酶TPERha，该重组酶TPERha最适反应温度高、具有较高的热稳定性，在优选条件下可高效表达目的蛋白，因此可在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中的鼠李糖等领域中具有广泛的应用。
[0009]技术方案:一种α -鼠李糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]编码上述α -鼠李糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]上述α -鼠李糖苷酶的制备方法，将SEQ ID N0.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌后诱导表达，并通过后续目的蛋白的纯化而得。
[0012]所述制备方法的具体步骤如下:
1)、以提取的?识petrophilaDSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID N0.2所示的DNA片段;
2)、将得到的DNA片段和pET-28b分别用NheI和NotI进行双酶切，连接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；
3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，加入适量浓度的诱导剂IPTG于30°C下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni2+亲和层析柱纯化即得。
[0013]包含上述α -鼠李糖苷酶的DNA片段的重组质粒。
[0014]上述α -鼠李糖苷酶在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中鼠李糖中的应用。
[0015]有益效果:(I)本发明所述的α -鼠李糖苷酶TPERha最适反应温度高，热稳定性优异；(2)本发明所述α-鼠李糖苷酶TPERha的优选制备方法可达到目的蛋白的较高表达。
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【附图说明】
[0017]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0018]图1为实施例2纯化的α-鼠李糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker (购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道I为纯酶蛋白;泳道2为PET_20b转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液；泳道3为诱导表达后全细胞裂解液。
[0019]图2为实施例3本发明所述α -鼠李糖苷酶的定性测定结果(图a, b, c, d)及黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适温度及温度稳定性的测定结果图(图e，f)，其中a为本发明所述α -鼠李糖苷酶的最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％ ;b为本发明所述α -鼠李糖苷酶的最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(°C)，纵坐标为相对酶活力，单位％; c为本发明所述α-鼠李糖苷酶的pH稳定性的测定结果图，横坐标为PH，纵坐标为相对酶活力，单位％; d为本发明所述α-鼠李糖苷酶的温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时(min)，纵坐标为相对酶活力，单位％。e为黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(0C )，纵坐标为相对酶活力，单位％ ;f为黑曲霉来源的α -鼠李糖苷酶温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时(min)，纵坐标为相对酶活力，单位％。
[0020]图3为实施例4本发明所述α -鼠李糖苷酶诱导表达结果图，其中纵坐标为相对酶活力，单位为％ ;横坐标为诱导条件的编号，其中1-5分别表示:1，30°C不加IPTG; 2，30°C加IPTG至终浓度0.0lmM; 3，30°C加IPTG至终浓度0.05mM ;4，30°C加IPTG至终浓度
0.1mM ;5，300CjJP IPTG 至终浓度 0.5mM。
[0021]图4为实施例5本发明所述α-鼠李糖苷酶的产酶曲线图，其中横坐标为诱导时间，单位(h);纵坐标为α -鼠李糖苷酶活力，单位U/mL。
[0022]图5为实施例6本发明所述α -鼠李糖苷酶水解橘皮苷的HPLC图谱。图5_a是灭活的重组a -L-鼠李糖苷酶酶液处理的橘皮苷的HPLC图谱，图5-b是重组a -L-鼠李糖苷酶处理的橘皮苷的HPLC图谱。橘皮苷保留时间为4.830 min，而橘皮苷经黑曲霉a -L-鼠李糖苷酶水解产物橘皮素单糖苷保留时间为5.457 min。
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【具体实施方式】
[0024]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]本发明提供了一种新型α -鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，命名为 TPERha0
[0026]本发明也提供了编码本发明所述α -鼠李糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列。
[0027]在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的α -鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0028]为了制备本发明所述酶蛋白，本发明还提供了本发明所述的α -鼠李糖苷酶的制备方法
在一些实施方案中，本发明所述的α -鼠李糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的α -鼠李糖苷酶的DNA分子片段，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌，加入诱导量浓度的诱导剂IPTG后进行诱导表