lecularWei曲tMarker(Low),购自TAKARA, 货号：3450)。
[0024] 图4显示本发明实施例3中各杂交瘤细胞株产生的抗proBDNF单克隆抗体与人 pro抓NF和人pro抓NF前体结构域的特异性抗原结合区域实验结果。
[002引图5显示本发明实施例4中的抗pro抓NF单克隆抗体抗体2B11与人pro抓NF前 体结构域、大鼠proBDNF前体结构域和小鼠proBDNF的特异性抗原实验结果。
[0026]图6显示本发明实施例3的抗proBDNF单克隆抗体2B11的亚型分析结果。
[0027] 图7显示本发明实施例6的人鼠嵌合抗体C肥Bll与本发明实施例1的人pro抓NF 蛋白的在不同稀释条件下的结合活性实验结果。
[0028] 图8显示尾静脉注射2B11相对于空白对照对由福尔马林引起的SD大鼠藤足时间 所代表的双相性疼痛的作用。
[0029] 图9显示尾静脉注射2B11相对于空白对照对由CFA足底注射诱发的慢性持续性 炎性痛的作用。
[0030] 图10显示尾静脉注射2B11在手术后相对于空白对照对大鼠后足切割痛的疼痛评 分的影响。
[0031] 图11显示尾静脉注射2B11在手术后相对于空白对照对大鼠后足切割痛的机械痛 域的影响。
[0032] 图12显示腹腔注射2B11相对于空白对照对醋酸诱发的小鼠扭体反应的作用。
【具体实施方式】
[0033] 本发明的抗pro抓NF抗体多肤，能够特异性识别pro抓NF的前体结构域 (pro-domain)第19位至第128位氨基酸，其包括包含如下氨基酸序列的重链可变区（a)女口 SEQIDNO: 1 所示的CDR1 区域，（b)如SEQIDNO: 2 所示的CDR2 区域，（C)如SEQIDNO: 3所示的CDR3区域，和/或包含如下氨基酸序列的轻链可变区；（d)如SEQIDNO: 4所示 的CDRl区域，（e)如SEQIDNO: 5所示的CDR2区域，（f)如SEQIDNO: 6所示的CDR3区 域。在各项疼痛评价实验中，该抗体处理的小鼠与空白对照组小鼠相比表现出显著的疼痛 抑制和预防效果。本发明的抗体多肤不仅抑制和/或预防各类急性，还可W抑制和/或预 防慢性疼痛，比如手术后疼痛，急性炎性疼痛，慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神 经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉神经痛、偏 头痛，复杂区域综合症等。
[0034] 本发明所述的"抗体多肤"指的是能够通过免疫球蛋白可变区内的至少一个抗原 识别位点特异性识别祀位点，例如多糖，多核巧酸，脂类，多肤等的免疫球蛋白分子。此处 所用的术语抗体多肤包括完整的多克隆抗体和单克隆抗体，还包括其片段，例如单链抗体 (scFV)，Fd片段，Fab片段，F(ab' )2片段，单结构域抗体片段，分离的CDR片段，及其衍生 物例如其突变体，或包含至少一个抗原结合位点的修饰的免疫球蛋白分子结构。
[00巧]完整抗体指由两个同样的重链和轻链组成，各条链分别包含一个可变区（V区）和 一个或多个恒定区（C区)。可变区负责与抗原结合，而恒定区主要负责结合效应分子。在各 可变区有H个具有高度多样性的柔性的环，称作互补决定区（CDR)，其主要负责识别抗原。 可变区的其他部分包含刚性的目片层并支持所谓的框架区（FRs)。CDR和FR间隔排列形 成H明治结构。
[0036]"单链抗体（scFV)片段"指的是通过基因工程构建的抗体片段，其是有通过接头 (linker)连接的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)的重组蛋白，接头使得该两个结构域 相关联W形成抗原结合位点。ScFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。
[0037] "Fd片段"指的是由重链VH和CH1组成抗体片段。
[003引"F油片段"指的是由Fd片段（由重链VH和CH1组成)和整条轻链通过链间二硫键 形成的异二聚物。"F油抗体"的大小是完整抗体的1/3,其只包含一个抗原结合位点。
[0039] "F(油'）2片段"指的是包含两个相连的F油片段的二价片段。
[0040]"单结构域抗体"由重链可变区或轻链可变区组成。由于该抗体片段只由一个结构 域组成，所W得名。该片段的大小是一个完整抗体的1/12。
[0041]"衍生物"包括例如当通过瞻菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如 BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与EGFR或CD3抗原表位结合的瞻菌 体抗体的效率（Schier，人抗体杂交瘤7 (1996)，97-105;Malmborg，免疫学方法杂志183 (1995)，7-13)。还包括，例如W0 89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400 和W090/07861中描述的人源化抗体产生的方法，W091/10741，W094/02602和W096/33735中 有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法。
[0042] 本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基 酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组W及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体 的氨基酸序列在其DNA序列中引入该种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的。
[0043] 本发明使用的抗体或抗体片段可W是人源化的，嵌合的或鼠源的。此处所用的"人 源化抗体"指的是具有对应于人所产生抗体的氨基酸序列的抗体，和/或通过本领域已知 的和本申请公开的制备人源化抗体的技术制备的抗体。人源化抗体主要指鼠源（或其它非 人源的）单克隆抗体W基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸 序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性， 有利应用于人体。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体(也称CDR植入抗体CDRgrafting antibody)、表面重塑抗体或全人源化抗体。人源化抗体还可W使用本领域已知的各种方法 产生，例如人源化抗体选自一个瞻菌体文库，其中该瞻菌体文库表达人抗体。人源化抗体还 可W通过在转基因动物中引入人免疫球蛋白位点而制备，所述的转基因动物例如，内源性 免疫球蛋白基因已经被部分或完全灭活的小鼠。此外，人源化抗体还可W通过使得产生针 对特定抗原的抗体的人B淋己细胞永生化而制备。
[0044]"嵌合抗体"指的一个抗体中重链和轻链的一部分氨基酸序列与来自一个特定种 类的抗体的对应的序列同源，但该链的其他部分与另一个特定种类的对应序列同源。典型 的是，在该些嵌合抗体中，重链和轻链的可变区都类似于一个哺乳动物种类的可变区，而 其恒定区域来自另一哺乳动物种类的序列同源。嵌合抗体的优势是，该些可变区可W方便 地从现有已知的来源使用现有可获得的非人源宿主的淋己瘤细胞或B细胞与来自例如人 细胞制备物得到的恒定区组合而制备。该嵌合抗体的特异性不受其来源的影响，由于其恒 定区为人源的，因此不太可能引起人受体的免疫反应。当然，嵌合抗体的定义不限于此处具 体所述例子的限定。
[0045]改型抗体也称CDR植入抗体（CDRgraftingantibody)，抗体可变区的CDR是抗 体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可 变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。 然而，抗原虽然主要和抗体的CDR接触，但FR区也常参与作用，影响CDR的空间构型。因此 换成人源FR区后，该种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区，可能改变了单抗原有的CDR构型， 结合抗原的能力会下降甚至明显下降。已能对抗体进行分子设计，在人源FR区引入鼠源FR 区的某些关键残基，如配置得当，其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当。
[0046] 表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是 仅替换与人抗体差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体 表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水 性，或可能形成氨键从而影响到抗体互补决定区（CDR)构象的残基尽量不替换。
[0047] 全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体 的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体 全人源化的目的。
[0048] 本文中所用的术语"竞争"指的是抗体多肤在体外实验中表现出免疫学竞争性，免 疫竞争的测定方法及其条件是本领域内公知的。与本发明的抗体多肤竞争的抗体多肤可W 包括，例如通过对抗体多肤的重链和/或轻链可变区的CDR区域（CDR1，CDR2,CDR3)的一个 或多个氨基酸或者抗体多肤的框架区的一个或多个氨基酸进行本领域内公知的基因工程 方法进行保守性替换，而得到的具有相似和/或相同的抗原结合性质的抗体多肤。
[0049] 在本发明的另一方面，涉及包含有编码上述多肤的核巧酸序列的载体。所述载体 可W是真核细胞载体或原核细胞载体，只要所述载体满足：（a)其编码序列包含复制起始 的序列，使得该载体能够在宿主细胞中得W复制，化）其包含有编码筛选标记的基因序列， 该基因编码的蛋白是该宿主细胞在特定的选择培养基中生存和生长所必需的。在宿主细胞 如果没有被转染或转化包含该基因的载体的情况下，宿主细胞不能在特定选择培养基中生 存。典型的筛选标记基因编码的蛋白包括具有对抗生素或毒素具有耐受性的蛋白，抗生素 或毒素包括例如氨予青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶岭等；补偿营养缺 陷的相关蛋白，供应培养基中不存在的关键营养成分，例如编码D-丙氨酸消旋酶基因。采 用抗性筛选的例子包括，通过转染包含新霉素抗性基因的外源载体，使宿主细胞获得在含 有药物新霉素或G418的培养基的情况下，继续生存生长。另外一个例子是在哺乳动物细胞 例如中国仓鼠卵巢细胞（CH0)中使用二氨叶酸还原酶（DHFR)筛选标记，哺乳动物细胞宿主 细胞是指DHFR缺陷型的细胞，不含二氨叶酸还原酶基因，不能合成核酸，必须在含有HT的 培养基里生长。在利用载体转染宿主细胞时，可W通过上述培养基条件的选择筛选得到同 时包含目的基因和DHFR基因的外源载体的阳性克隆，（C)其编码序列包含启动子的序列， (d)表达载体还可能包括其它组成