)中并在25 °C以5500 g离心10分钟。弃去上清，将来自300 ml培养物的沉淀重悬于50 ml pH7的转化缓冲液(转化缓冲液组成:8 g/1 (NH4)H2PCV0.5 g/1 NaCl、0.49 g/1 MgS04*7H20、50 mg/1 卡那霉素硫酸盐、15 ml/1微量元素溶液US3 ;用25%氨溶液将pH调节至7.0)中。
[0053]装好300 ml发酵罐，其包含130 ml pH7的转化缓冲液和大约3滴高压蒸汽灭菌的消泡剂反应物(Delamex)。由含有由25 %正丁烷和75 %合成空气组成的混合物的压力气体瓶(初始压力4 bar)通过孔径为0.2 Mm的sinterperlator向发酵罐供应气体，流速为大约10 lN/ho在水浴中对发酵罐进行搅拌并在水浴中将发酵罐温度调节为30 °C，并使用磁力搅拌器以900 rpm的速度进行搅拌。使用2.5%氨水保持pH值为7.0。连续加入葡萄糖溶液(葡萄糖加料速度为0.3 g/h)。要弃去的空气被转至包含150 ml水的冰冷洗瓶中。
[0054]使用50 ml重悬的预培养物沉淀接种发酵罐。
[0055]发酵罐中的生物质的浓度，如在600 nm时光密度所示，为16。在不同的时间点从发酵罐和洗瓶中取10 ml样品。将发酵罐样品以10000 g的速度在室温离心10分钟，用0.2 μ m滤器过滤上清。
[0056]使用HPLC-RID和Agilent Technologies 1200系统对1-丁醇进行色谱分析。使用Aminex HPX-87H柱(300 mm x 7.8 mm)。系统操作使用10 mM H2SO4作为运行试剂，流速为0.6 ml/min，柱温度为40 °C。用最纯的水制备要分析的所有物质的标准品，并在相同条件下测量。通过比较保留时间值进行分析。
[0057]使用GC-MS (TraceGC Ultra/DSQ II 来自 ThermoScientif ic，毛细管柱:30 m x0.25 mm ZB-WAX df:0.259 m，P013)对1，4-丁二醇进行定性分析。使用冷的丙酮对样品进行蛋白质沉淀(样品/丙酮1:9)。对离心的上清进行GC-MS分析。通过将测量光谱和数据库光谱进行比较来鉴别物质。可以使用其E1-光谱鉴别1，4-丁二醇，其可以确定为保留时间为19.88 min的峰。
[0058]为了确认属性(identity)，在样品中掺入10 mg/1 1，4_ 丁二醇标准品。图1显示了 1，4_ 丁二醇的特征片段离子m/z 71的离子流色谱。通过比较掺入标准品和未掺入标准品的样品的峰面积，并考虑稀释系数(VF = 10)，可以估算1，4-丁二醇的浓度为17 mg/? ο
[0059]实施例2:
将正丁醇氧化为1，4_ 丁二醇
可以看到，实施例1中使用的菌株不仅可以将丁烷，还可以将正丁醇转化为1，4_ 丁二醇。
[0060]接种前培养:制备I L LB培养基(5 g/Ι酵母提取物、10 g/Ι蛋白胨、0.5 g/1NaCl，溶解于I L水中，121 °C高压蒸汽灭菌20分钟)
将该溶液转移至三个100 ml的带挡板的烧瓶中，每个25 ml，补充25 μ?过滤灭菌的卡那霉素溶液(50 g/Ι)并用大肠杆菌 W3110 pC0M10[Ab_Fd / CYP153-2 / FdOR / alkL]的甘油冷冻培养物进行接种，每个烧瓶200 ml ο这些培养物在37 °0和200 rpm (幅度2.5cm)的条件下温育20小时。
[0061]种子培养:制备I L 改良 M9-培养基，包含 6.8 g/1 Na2HPO4,3 g/1 KH2PO4U5 g/I酵母提取物、0.5 g/1 NaCl、2 g/1 NH4Cl,15 ml微量元素溶液US3 (I L微量元素溶液US3 包含 36.5 g HCl 37 %、1.91 g MnCl2 x 4Η20、1.87 g ZnSO4 χ 7Η20、0.84 g 乙二胺四乙酸钠二水合物、0.3 g Η3Β03、0.25 g Na2MoO4 χ 2Η20、4.7 g CaCl2 χ 2Η20、17.3 g FeSO4 χ7 H2O,0.15 g CuCl2，溶于 I L 水中)I ml (MgSO4 χ 7Η20)_ 溶液(246, 47 g/1),30 ml 葡萄糖溶液(500 g/1)。对含有似2即04至NH 4C1的954ml溶液进行高压蒸汽灭菌，其它组分单独进行过滤灭菌并随后加入。pH为6.8。
[0062]将3 χ 175 ml改良的M9-培养基转移至1000 ml带挡板的摇瓶中，补充75 μ?过滤除菌的卡那霉素溶液(50 g/Ι)，每个用25 ml接种前培养物接种，并在37 °0和200 rpm的转速(幅度2.5 cm)的条件下温育。在37 V 2.5 h之后，将温度降低至25°C。在25°C0.5 h之后，用0.4 mM DCPK诱导培养物，并在25°C再温育16 h。
[0063]以无菌方式合并摇瓶中的培养物，并在离心瓶中离心(6000g，10 min, 25°C)。弃去上清，并将沉淀重悬于30 ml 70 mM pH7的磷酸铵缓冲液(组成:8 g/L (NH4) H2PO4、0.5g/L NaCl、0.49g/L MgSO4 χ 7Η20、15 ml 微量元素溶液 US3 和 50 μ g/1 卡那霉素、用 5 %NH4OH调节pH)中。
[0064]生物转化:
将包含大约3滴高压蒸汽灭菌的消泡剂反应物(Delamex)的150 ml磷酸铵缓冲液转至无菌的300 ml发酵罐中。通过孔径为0.2 μπι的金属sinter perIator向发酵罐中引入空气，流速为大约10 Nl/ho使用水浴将发酵罐的温度保持在30 °C，使用磁力搅拌器以900 rpm的转速搅拌其内容物。流出的空气穿过包含150 ml水的冰冷的洗瓶。
[0065]用30 ml重悬的生物质沉淀通过取样管接种发酵罐。用2.5%氨溶液将pH保持在7.0。连续供给含有30 g/Ι葡萄糖和50 g/11- 丁醇的补料溶液，加料速度为1.12 ml/h?
[0066]在0.2、2、4、7、22.5、30.5和46.6小时后每次从发酵罐取6 ml样品。在10000 g和室温下离心样品，并过滤上清。使用GC-MS进行色谱分析。在磷酸铵缓冲液中制备1，4-丁二醇标准品。
[0067]I, 4- 丁二醇随时间的浓度如图3所示。
【主权项】
1.一种方法，包括以下步骤 a)提供烧径或1-烧醇， b)使所述烷烃或1-烷醇在水溶液中与来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶和氧气接触至少3小时。
2.来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶在使烷烃或1_烷醇转化为相应的α，ω-二醇中的用途。
3.根据权利要求1-2任一项的方法或用途，其中在存在来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶的条件下温育烷烃或1-烷醇至少3、优选16、最优选24小时。
4.据权利要求1-3任一项的方法或用途，其中，除了来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶之外，还存在铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，其中铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶均能够在功能上与所述来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶相互作用。
5.据权利要求1-4任一项的方法或用途，其中来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃轻化酶是来自泊库岛食烧菌iAlcrniivorax borkumensis)的CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶(登录编码YP_691921)或其变体，铁氧还蛋白是(登录编码ΥΡ_691921)或其变体，并且铁氧还蛋白还原酶是(登录编码ΥΡ_691923)或其变体。
6.据权利要求1-5任一项的方法或用途，其中所述烷烃或1-烷醇是具有1-7个，优选1-4个碳原子的烷烃。
7.根据权利要求6的方法或用途，其中所述烷烃是丁烷或异丁烷。
8.据权利要求1-5任一项的方法或用途，其中所述烷烃或1-烷醇是具有1-7个碳原子的1-烷醇，优选丁醇或异丁醇。
9.根据权利要求8的方法或用途，其中所述烷烃以1-50，优选1-20，最优选1-10bar的分压提供。
10.据权利要求1-9任一项的方法或用途，至少一种选自包含来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的组的酶以表达所述一种酶或多种酶的全细胞催化剂的形式提供。
11.根据权利要求10的方法或用途，其中所有选自包含来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的组的酶以表达所述酶的全细胞生物催化剂的形式提供。
12.根据权利要求10-11任一项的方法或用途，其中至少一种，优选所有选自包含来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的组的酶是重组的和/或过表达的，优选是过表达的。
13.根据权利要求10-12任一项的方法或用途，其中所述全细胞生物催化剂表达来自AlkL家族的多肽，优选来自恶臭假单胞菌iPsoudomorms putida)的AlkL(登录编码CAB69081)或其变体。
14.根据权利要求10-13任一项的方法或用途，其中所述全细胞生物催化剂是原核细胞，优选大肠杆菌(疋col?) 0
15.根据权利要求1-14任一项的方法在使烷烃转化为相应的α，ω-二醇中的用途。
【专利摘要】本发明涉及包括如下步骤的方法a)提供烷烃或1-烷醇，b)使所述烷烃或1-烷醇在水溶液中与来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶和氧气接触至少3小时。
【IPC分类】C12N9-02, C12P7-18
【公开号】CN104781410
【申请号】CN201380060101
【发明人】P.恩格尔, T.哈斯, J.C.普费弗, O.图姆, C.格林
【申请人】赢创工业集团股份有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年11月6日
【公告号】CA2888073A1, EP2733215A1, EP2922963A1, WO2014079683A1