[0034] 将HPV52L1氨基酸序列转换为真核汉逊酵母偏爱密码子模式的核苷酸序列。重建 HPV52L1序列被工程改造，以删除任何可能的转录提前终止位点以确保稳固的转录。首选 兼并密码子中真核汉逊酵母偏爱性处于第一位的密码子，主要使用兼并密码子中真核汉逊 酵母偏爱性处于第一第二位的密码子，少数情况使用第三位的密码子完成局部调整，利用 DNAMAN软件避免过长互补序列、重复序列，通过RNA结构预测，避免过长复杂的发卡结构， 排除强二级结构，增加特异性的分子内部稳定性。基因的核苷酸序列中还避免出现可能对 基因转录、转译效率带来不利影响的序列，如内含子剪接序列、转录终止序列、内部启动子 序列（TATA)和核糖体结合位点（GGAGG)等。转录终止序列主要有：ATTATTTTAT、TTTTTATA、 TAG(富含T)TA(G)GT、（富含AT)TTT等。最终确定整个序列，如序列表中SEQ ID NO. 1所 示。利用全人工合成方法合成序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
[0035] 对HPV58L1来说，氨基酸序列全长498氨基酸，转换为真核汉逊酵母偏爱密码子模 式的核苷酸序列。采用如上述HPV52L1 -样的转换思路和方法，重建HPV58L1序列被工程 改造，以删除任何可能的转录提如终止位点以确保稳固的转录。最终整个序列，如序列表中 SEQ No. 2所示。利用全人工合成方法合成序列表中SEQ No. 2所示的DNA序列。
[0036] 实施例2表达载体的构建
[0037] (1)HPV52L1表达载体的构建
[0038] 利用全人工合成方法合成序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，序列两端加上 限制性内切酶EcoR I和BamH I的识别位点。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列， 电泳回收酶切后的片段，-20°C保存备用。
[0039] 以汉逊酵母CGMCC 22497基因组DNA为模板，克隆1.5kb的甲醇氧化酶基因 (MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因（MOX)终止子、LOkb的自主复制序列HARS ;并 从YIp5 (Genbank Acession NO. L09157)质粒中克隆出I. Ikb的酿酒酵母尿脲嘧啶基因 ScURA3 ;将上述4部分连接后，插入pBluescrip II质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体 pMPT-02。
[0040] 用EcoR I和BamH I酶切载体pMPT-02,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的大 片段，在T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的SEQ ID NO. 1所示合成的DNA序列连接， 连接反应在16°C下隔夜，反应液转化天根生化科技（北京）有限公司T0P10感受态细胞， 用带氨苄青霉素抗性的平皿筛选转化子，对平皿上长出的大肠杆菌转化子使用引物primer fdl5 '-ATGTCTGTTTGGAGACCGTC- '3 和 primer fd2 5 '-GGGATCCGTGTAATTATCTCTTGAC- '3 通过PCR扩增筛选含载体pMPT-HPV52Ll的转化子，筛选得到的转化子扩大培养，用宝生 物工程大连有限公司的质粒回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0)提纯得到表达载体pMPT-HPV52Ll，载体构建示意图见附图1。
[0041] (2)以相同方法和步骤构建HPV58L1表达载体，见附图2。
[0042] 利用全人工合成方法合成序列表中SEQ ID NO. 2所示的DNA序列，序列两端加上 限制性内切酶EcoR I和BamH I的识别位点。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列， 电泳回收酶切后的片段，-20°C保存备用。
[0043] 以汉逊酵母CGMCC 22497基因组DNA为模板，克隆1.5kb的甲醇氧化酶基因 (MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因（MOX)终止子、LOkb的自主复制序列HARS ;并 从YIp5 (Genbank Acession NO. L09157)质粒中克隆出I. Ikb的酿酒酵母尿脲嘧啶基因 ScURA3 ;将上述4部分连接后，插入pBluescrip II质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体 pMPT-02。
[0044] 用EcoR I和BamH I酶切载体pMPT-02,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的 大片段，在T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的合成的DNA序列连接，连接反应在 16°C下隔夜，反应液转化天根生化科技（北京）有限公司T0P10感受态细胞，用带氨苄 青霉素抗性的平皿筛选转化子，对平皿上长出的大肠杆菌转化子使用引物primer fd3 5 '-ATGTCCGTGTGGCGTCCTTCGG- '3 和 primer fd4 5 '-TTACTTCTTGACCTTC- '3 通过 PCR 扩 增筛选含载体PMPT-HPV58L1的转化子，筛选得到的转化子扩大培养，用宝生物工程大连有 限公司的质粒回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2.0)提纯 得到表达载体PMPT-HPV58L1，载体构建示意图见附图2。
[0045] 实施例3表达载体电转化真核汉逊酵母感受态宿主细胞
[0046] (l)pMPT-HPV52Ll 感受宿主细胞
[0047] 用Sac I分别酶切载体pMPT-HPV52Ll，使载体线性化。线性化的载体通过电转化 法（天津理工大学生产的1^-101型基因脉冲导入仪，1.51^，50以？，200〇,3-511156(3)转化 真核汉逊酵母RB-11 (直接购自德国莱茵生物公司，RB-11细胞株为LR9细胞株的改良衍生 株 Roggenkamp. R etal.，1986Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorpha by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202:302, RB-II细胞株为Y -乳清酸苷磷酸脱羧酶基因缺陷性突变株，已被广泛应用于工 业重组菌的构建）。在含有1. 34% YNB (酵母氮源基础培养基）和2%葡萄糖的培养基平板 上筛选转化子。通过PCR筛选产生的菌落中正确方向的HPV 52L1插入片段。将酵母转化 混合物铺平板在MD固体培养基中，并在30°C倒置培养3-5天。挑取菌落并在平板上划线进 行克隆分离。分离的菌落随后在旋转管培养中于37°C生长以诱导Ll转录和蛋白表达。48 小时后，沉淀相当于〇D_= 10量的细胞，除去上清液和冷冻沉淀并保存在-70°C。
[0048] (2)pMPT-HPV58Ll感受宿主细胞：采用与（1)中基本相同的方案，使用载体 PMPT-HPV58L1转化真核汉逊酵母RB-Il。
[0049] 实施例4目的基因的筛选、测序和检测
[0050] (1)细胞破碎：取约ImLODax!为10的酵母菌体至I. 5mL离心管，6000rpm离心5min 后去上清，加入与沉淀菌体体积相同的酸洗玻璃液，100 μ L细胞破碎液，至于振荡器上震荡 5-10min〇
[0051] (2) DNA抽提：细胞破碎完成后，在离心管中加入100 μ L无菌水，再加 100 μ L酚、 氯仿抽提液，混勾后4°C放置十分钟，1000 Orpm离心5min，取上清1 μ L用于扩增反应。
[0052] (3) PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
[0053] 使用引物 primer fd3 5 '一ATGTCCGTGTGGCGTCCTTCGG -'3 和 primer fd4 5 '一 TTACTTCTTGACCTTC-'3对以上制备的DNA模板PCR扩增，以上引物可同时扩增真核汉逊酵 母单拷贝的MOX基因和整合的HPV58L1基因。所扩增HPV58L1片段长度为1500bp，MOX片 段长度为2060bp，在1. 0%琼脂糖凝胶加样孔中上样5 μ L，电泳完毕取出凝胶摄像，电泳照 片见附图3,其中1500bp左右条带为HPV58L1基因，2000bp左右条带为MOX基因。其中1、 9道是高拷贝转化子，5、7、8道是较高拷贝转化子，2、3、4、6道是低拷贝转化子，10道是阴性 对照的宿主菌，11道是DL2000Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp和500bp。以 上扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳后用DNA纯化试剂盒抽提1500bp的DNA片段进行基因 测序，与设计基因比对结果一致。
[0054] (4)多拷贝转化子实时定量PCR检测拷贝数
[0055] 已知MOX基因为真核汉逊酵母的单拷贝基因，以NOX基因为内标，设计引物对同一 样品同时扩增MOX基因片段和HPV58L1基因片段，并用荧光定量PCR仪检测，由于MOX基因 在真核汉逊酵母基因组中是单拷贝，故HPV58L1片段的量/MOX片段的量即为每个细胞的 HPV58L1基因的拷贝数。基因通过质粒载体转化到受体菌并稳定整合后才能高效表达，其拷 贝数一定程度上反映高效表达的工程菌株表达目的蛋白的特性。
[0056] 两对引物均使用软件Primer5设计，由大连宝生物工程有限公司代理 合成。扩增HPV58L1基因片段的引物序列如5' -TCTGAGCCCTATGGCGATT- '3和 5 ' -AGCGGAAGACTGGATGACA- ' 3所示，片段长度为156bp。扩增MOX基因片段的引物序 列分别为MOX primer forward (Sp2) :5 '-GCCACCTTCTACTCGTCCAG- '3 和 MOX primer forward (As2) :5'-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG- '3,片段长度为 145bp〇
[0057] 模板DNA制备同上述DNA抽提方法，其稀释如下：标准品稀释，取某一样品抽提得 到的DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释4次，此稀释要求精确。 样品稀释，取其他样品用抽提得到的DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10 倍，稀释2次，此稀释不要求精确。