定在灭菌的50mL离心管上，向column内加入15mL Buffer N5洗脱（提前50°C预热）。让 Buffer N5洗脱液由于重力滴入离心管内。待收集完洗脱液，加 IlmL常温的异丙醇到离心 管内，轻轻颠倒混匀，16000g，4°C离心30min。小心吸弃上清液，加入常温70 %乙醇5mL，震 荡涡旋混匀，1600(^，离心1011^11。小心用11^移液枪吸弃70%乙醇，室温干燥201^11。加 200 μ L灭菌蒸馏水溶解。
[0109] (2)BAC-HSV-1-1737 质粒和 BAC-HSV-1-1737 AUL18 质粒转染 Vero 细胞：用 6 孔 板培养Vero细胞（ATCC)，待细胞密度长至50~70 %时，进行两种质粒的转染。将不同量 的 BAC-HSV-11737 质粒和 BAC-HSV-1-1737 AUL18 质粒分别取 1 μ g、2 μ g、3 μ g、4 μ g 溶于 250 μ L转染培养基Opti-MEM，室温静置5min。将siRNA-Mate加入混有质粒的转染培养基 中，形成转染复合物，室温静置l〇min。将转染复合物加入到含有2mL维持液的6孔板中。 同时设置HSV-I病毒对照组和正常细胞对照组。于转染后在显微镜下观察病变情况。病毒 病变CPE观察结果：转染BAC-HSV-1-1737 Λ UL18质粒的细胞孔内和正常细胞对照组孔内没 有细胞病变空斑出现，在BAC-HSV-1-1737质粒转染孔内，HSV-I对照组孔内皆有细胞病变， 产生病毒感染空斑，证明去除UL18基因的HSV-I失去致病变的能力。
[0110] (3)BAC-HSV-1-1737 AUL18 质粒和 pcDNA3. 1-UL18 质粒（表达 UL18 基因编码的 蛋白，由本实验构建并保存。构建流程参考实施例1，首先通过PCR扩增全长UL18基因， 所用引物为 HindIII-UL18-Forward :CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCTGGCGGACGGC，UL18-BamHI-Reverse :CGCGGATCCGCGTTAGGGATAGCGTATAACGGG，PCR 扩增所用模板为 BAC-HSV-1-1737 质 粒。通过胶回收获得985bp的HindIII-UL18-BamHI片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测。采 用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I试剂盒进行pcDNA3. 1+(购自addgene)质粒的抽提，并用 HindIII (购自 TAKARA)和 BamHI (购自 TAKARA)对 pcDNA3. 1+ 质粒和 HindIII-UL18-BamHI 片段进行双酶切。双酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过胶回收获得酶切后的质粒 和片段。最后通过DNA连接酶对pcDNA3. 1+质粒和HindIII-UL18-BamHI片段进行连接，并 将连接产物转化至DH5 α E. Coli，挑取克隆进行PCR、酶切及测序鉴定。将鉴定获得的阳性 克隆命名为PCDNA3.1-UL18,保存于-80°C冰箱。）共转染Vero细胞（ATCC):按照上述转 染方法分别将3 μ g的BAC-HSV-1-1737 Δ UL18质粒和pcDNA3. 1-UL18质粒溶于250 μ L转 染培养基Opti-MEM，室温静置5min。将siRNA-Mate加入混有质粒的转染培养基中，形成转 染复合物，室温静置lOmin。将转染复合物加入到含有2mL维持液的6孔板中。同时设置 HSV-I病毒对照组和正常细胞对照组。于转染后在显微镜下观察病变情况。病毒病变CPE 观察结果。结果显示共转染BAC-HSV-1-1737 AUL18质粒和pcDNA3. 1-UL18质粒的细胞孔 内和HSV-I孔内皆有细胞病变，产生病毒感染形成的空斑，正常细胞对照组没有细胞病变， 无病变空斑产生。证明利用BAC-HSV-1-pREDI体外基因敲除系统成功将HSV-I的UL18基 因敲除，获得了病毒基因缺陷株。
[0111] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种HSV-I病毒体外基因敲除系统，其特征在于：所述的HSV-I病毒体外基因敲除 系统为含有BAC-HSV-I载体和pREDI重组载体的细菌细胞； 所述的BAC-HSV-I载体为载有HSV-I病毒全基因组的细菌人工染色体； 所述的PREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的载体； 所述的阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点可分别诱导Cre-recombinase重组酶和 重组限制性内切酶I-SecI的表达； 所述的重组限制性内切酶I-SecI可识别I-SecI识别位点。2. 根据权利要求1所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统，其特征在于： 所述的细菌细胞为EPI300E. Coli细菌； 所述的PREDI重组载体为含有阿拉伯糖诱导位点和鼠李糖诱导位点的pKD46载体。3. 权利要求1或2所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于包含 如下步骤： (1)pREDI重组载体的构建： ① 根据启动子PrhaB编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到启动子PrhaB 编码基因的DNA片段； ② 根据重组限制性内切酶I-scel编码基因的序列信息，设计PCR扩增引物，扩增得到 重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段； ③ 通过重组PCR连接步骤①扩增得到的启动子PrhaB编码基因的DNA片段和步骤②扩 增得到的重组限制性内切酶I-SecI编码基因的DNA片段，获得PrhaB-I-SecI片段； ④ 将PrhaB-I-SecI片段和pKD46A-red recombinase载体连接，获得pREDI重组载 体； (2) 含有BAC-HSV-I载体和pREDI重组载体的细菌细胞的构建： 将步骤（1)制备得到的PREDI重组载体转入含有BAC-HSV-I载体的细菌细胞中，获得 含有BAC-HSV-I载体和pREDI重组载体的细菌细胞，即为HSV-I病毒体外基因敲除系统。4. 根据权利要求3所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于： 步骤⑴①中所述的PCR扩增引物为： PrhaB-F :5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3' ； PrhaB-R :5'-ATTACC TGGTTT TTTTGA TGCATT ATGTGA TCCTG-3'。5. 根据权利要求3所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于： 步骤⑴②中所述的PCR扩增引物为： I-SceI-F:5,-TTAGACTGGTCGTAATGAAATTCAGCAGGATCACATCTGGGTC-3，；I-SceI-R：5'-CATGCCATGGGTCGACTTATTATTTCAGGAMGTTTCGGAGGAGATAG TG-3, 。6. 根据权利要求3所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统的制备方法，其特征在于： 步骤（1)③所述的重组PCR的扩增引物为： PrhaB-F :5'-CATGCC ATGGGG CATGGC GAATTA ATCTTT CTGCG-3' ； I-SceI-R：5'-CATGCCATGGGTCGACTTATTATTTCAGGAMGTTTCGGAGGAGATAG TG-3, 。7. 权利要求I或2所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应 用。8. 根据权利要求7所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应 用，其特征在于包含如下步骤： (1) 通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段： ① 分别通过PCR扩增获得的靶基因上下游同源片段A-C段、正向筛选标记基因Ml片 段、反向筛选标记基因M2-B片段； ② 通过重组PCR将正向筛选标记基因Ml片段和反向筛选标记基因M2-B片段连接，获 得标记基因Ml-标记基因M2-B片段，标记基因Ml片段与标记基因M2-B片段中间含有重组 限制性内切酶I-SecI的识别位点； ③ 再次通过重组PCR将标记基因Ml-标记基因M2-B片段与A-C段相互连接，获得 A-C-标记基因Ml-标记基因M2-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段； (2) HSV-I靶基因敲除： 将步骤（1)制备得到的靶基因敲除同源重组片段转化到HSV-I病毒体外基因敲除系统 中，经过诱导剂阿拉伯糖和鼠李糖分别诱导相关蛋白酶的表达，进行基因的重组及筛选抗 性基因的去除，得到完全敲除缺失靶基因的BAC-HSV-I; 步骤（1)中所述的靶基因上下游同源片段A-C段长0. 6~I.Okb，为长20~SObp的靶 基因上游同源片段A与靶基因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片 段C上游； 步骤（1)中所述的反向筛选标记基因M2-B片段为反向筛选标记基因M2片段与长20~SObp的靶基因末端同源片段B通过PCR连接，其中，标记基因M2片段位于同源片段B上游。9. 根据权利要求8所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应 用，其特征在于： 所述的通过PCR扩增获得靶基因敲除同源重组片段，通过如下步骤进行： ① 分别通过PCR扩增获得长0. 7~0. 9kb的靶基因上下游同源片段A-C段、长I. 0~ I. 2kb的正向筛选标记基因卡那霉素抗性基因Kanr片段、长1. 9~2.Ikb的反向筛选标记 基因SacB-B片段； ② 通过重组PCR将Kanr片段与SacB-B片段连接，获得长2. 9~3. 3kb的Kanr-SacB-B 片段，Kanr与SacB-B中间含有重组限制性内切酶I-SecI的识别位点； ③ 再次通过重组PCR将Kanr-SacB-B片段与A-C段相互连接，获得长3. 6~4. 2kb的 A-C-Kanr-SacB-B全长同源重组片段，即为靶基因敲除同源重组片段。10. 根据权利要求9所述的HSV-I病毒体外基因敲除系统在病毒基因敲除领域中的应 用，其特征在于： 所述的靶基因上下游同源片段A-C段为长20~60bp的靶基因上游同源片段A与靶基 因下游同源片段C通过PCR连接，其中，同源片段A位于同源片段C上游； 所述的反向筛选标记基因SacB-B片段为SacB基因片段与长20~60bp的靶基因末端 同源片段B通过PCR连接，其中，SacB基因片段位于同源片段B上游。
【专利摘要】本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种HSV-1病毒体外基因敲除系统及其制备方法与应用。本发明中构建了可以进行诱导表达Cre-重组酶和I-Sce Ⅰ内切酶的pREDI质粒，并将pREDI质粒、BAC-HSV-1质粒和含有HSV-1病毒靶基因同源片段的DNA片段同时转化到细菌细胞内，在阿拉伯糖和鼠李糖的诱导下，经过同源重组和筛选标记的切除，获得敲除掉靶基因的BAC-HSV-1，从而实现体外快速敲除HSV-1病毒的特定基因。该系统具有快速高效，操作过程简单，成功率高，安全性高等优点，可用于构建临床基因缺陷活疫苗，也可作为对HSV-1特定靶基因功能研究的工具，因此具有很大的科研及临床应用潜力。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/63, C12R1/19
【公开号】CN104894046
【申请号】CN201510288180
【发明人】任哲, 王一飞, 王巧利, 金福军
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日