BS的DMEM冲洗两次，以 移除胶原酶。进行原代培养时，在六孔板上放入经10Ug/ml纤连蛋白涂覆的盖玻片，并将 对台盼蓝呈阴性反应的细胞以每孔6000个的密度培养于六孔板中，所用的培养基为DMEM 并添加10%FBS与1 %青霉素/链霉素。隔天，将培养基换成标准增殖培养基（由10% FBS-DMEM、0.ImM抗坏血酸、0. 5mg/mlL-葡萄糖、lOOmMHEPES、lmM丙酮酸钠、2mML-谷氨 酰胺与抗生素组成），培养基中可添加或不添加50nMPEDF肽。每3天更换新鲜培养基，共 培养12天。
[0084]〈间充质干细胞的分离与培养〉
[0085] 8周大成年雄性Sprague-Dawley大鼠经腹腔内注射甲苯噻嘆（每公斤体重10毫 克）以进行麻醉。在无菌环境下移出股骨，以PBS和抗生素的混合物冲洗约5分钟后，切除 所有软组织、将其股端（epiphysis)截断，之后以肝素和DMEM混合物反复冲洗骨髓腔。将 收集到的细胞以lOOOXg离心10分钟，而后将细胞沉淀物重新溶于DMEM中，并将此细胞悬 浮液转移到含有5毫升Percoll (1. 073g/ml)的15-ml离心管中，以1500Xg离心30分钟。 之后取出位于中间层的单核细胞，以PBS冲洗三次后，重新悬浮于低葡萄糖含量的DMEM(添 加10%经热灭活的FBS与1%青霉素/链霉素）。细胞在95%空气和5%二氧化碳以及 37°C的环境下培养，每4天更换培养基。弃置未贴附的细胞，并保留贴附细胞。在培养约一 周后，原代间充质干细胞（MSC)会长至约80 - 90%铺满。
[0086] 欲引发间充质干细胞分化形成软骨，将5X105个增殖的MSC培养于软骨生成培养 基（chondrogenicmedium)中，此培养基为高葡萄糖含量的DMEM培养基，含有100nM地塞 米松、0. 17mM抗坏血酸-2磷酸盐、10yg/ml胰岛素、5yg/ml转铁蛋白、5ng/ml硒、ImM丙酮 酸钠、2mML-谷氨酰胺与2%FBS)，并添加10ng/mlTGF- 0 2 (安迪生物（R&DSystems)，明 尼苏达，明尼阿波利斯）。在PEDF处理组中，将细胞培养于上述软骨生成培养基中，并添加 50nM的PEDF肽。每两天更换一次培养基，培养一周。
[0087]〈组织学分析〉
[0088] 切下膝关节后，移除周围软组织，将样品以4%多聚甲醛固定后，利用Shandon TBD-2脱钙剂（购自赛默科技公司（ThermoScientific，犹他州，洛根）处理。之后沿着关 节中央径向（mid-sagittally)切开，再以石赌块包埋。切片沿纵向切（厚度约5ym)。
[0089] 于使用前，于二甲苯中脱蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇再水合。之后，样品可用 苏木精和曙红（H&E)染色，或用于免疫组化检查。小心为每个膝盖制备20个切片，以尽可 能涵盖退化最严重的部分。
[0090] 〈免疫荧光染色与BrdU染色〉
[0091] 经石蜡包埋的关节样品于二甲苯中脱蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇再水合。脱 蜡的样品在室温下以INHC1处理1小时，而后再进行免疫荧光研宄。
[0092] 进行免疫染色研宄前，将样品以10%山羊血清和5%的BSA处理约1小时以进 行阻断。之后以抗-蛋白聚糖（稀释比1:100)、抗-II型胶原蛋白（稀释比1:100)与 抗-BrdU(稀释比1 :100)的一级抗体在37°C下培育2小时，再和与适当的若丹明或FITC 结合的驴IgG于室温下培育1小时，从而进行免疫染色。用Hoechst33258进行对比染 色7分钟，以定位核。使用配有CO)照相机的Zeiss焚光显微镜（Zeissepifluorescence microscope)来撷取样品影像。计算细胞数目时，从每一切片中随机选取20个视野，由不知 道实验分组的人员人力计算，并重复三次。
[0093] 〈RNA提取与反转录聚合酶链式反应（RT-PCR) >
[0094] 利用TRIzol自细胞内提取出总RNA，并以不含RNA酶的DNA酶1(恰根公司， 加州，圣地克拉力塔（SantaClarita))处理以移除基因组DNA，之后以RNA纯化试剂盒 (Dynabeads)进行纯化。在20y1的反应缓冲液（含0. 25yg的随机引物与0. 8mMdNTP)中 加入1yg取自BM-MSC的总RNA与200单位的扩增反转录酶（罗氏，德国曼海姆），于42°C 下反应1小时，以将RNA反转录为cDNA。
[0095] 取2 y 1的cDNA作为PCR反应的模板。PCR反应的反应体积为30 y 1，其中含有 15yl的EconoTaq?PLUSGREEN2XMasterMix(Lucigen? 公司）、lyM的各种引物以 及2y1的模板DNA。在18 - 22轮的扩增反应中合成cDNA(变性：20秒、94°C;退火：30秒、 57°C;以及聚合：40秒、72°C)。每种引物组所用的循环数落在扩增的线性范围内。特异性 PCR引物序列为：大鼠蛋白聚糖（登陆号：J03485)，正向：TTGGAAATCCAGAACCTTCG(SEQID N0:12);反向，GTCCAGTGTGTAGCGTGTGG(SEQIDN0:13)，其PCR产物大小约 149bp;大鼠甘 油醛 3-磷酸去氢酶（GAPDH)基因（登陆号：X02231. 1)，正向，AGACAGCCGCATCTTCTTGT(SEQ IDN0:14);反向，CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT(SEQIDN0:15)，而PCR产物的大小约 207bp。利 用含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析，并以UV光照使其显影。利用 FUJILAS-3000系统与MultiGaugeVer. 1.01软件（富士胶片株式会社，日本东京）对PCR 产物进行光密度法定量分析其强度。
[0096]〈统计分析〉
[0097] 将结果表示为平均值土平均值的标准差（SEM)。利用单向ANOVA分析来进行统计 比较。除非另有说明，P〈〇. 05时具有统计上的显著差异。
[0098] 实验例1
[0099]PEDF肽体内促进软骨细胞增殖与软骨再生
[0100] 膝盖骨关节炎是一种常见的慢性退行性疾病，其特征是关节软骨的减损。单碘乙 酸是一种糖解抑制剂，已知将MIA注射至啮齿动物的股胫关节空间会引发关节软骨的流 失，此过程与人类骨关节炎的症状相近。研宄显示，在注射MIA后7天，通常会出现严重的软 骨细胞退化与坏死。因而，在MIA注射后第8天开始进行PEDF肽治疗，以探宄本发明PEDF 肽是否可促进软骨再生。
[0101] 将大鼠随机分派至六个实验组，每组6只，并分别接受以下处理。HA组的大鼠接 受25y1浓度为5%的透明质酸注射。在载体/HA组中，大鼠用再溶于25y1的5%透明质 酸的DMSO载体处理。在29-聚体/HA、24-聚体/HA、20-聚体/HA与18-聚体/HA组中，大 鼠接受再溶于25yl的5%透明质酸中的0.2mMPEDF肽（29-聚体、24-聚体、20-聚体或 18-聚体）。以上处理皆透过单剂关节内注射，分别在MIA注射后第8、12、16与20天注射 一次。
[0102] 在MIA注射后第18天与第25天取得关节样品，经H&E染色后的代表性照片如图 1所示。与未接受MIA注射的正常关节相比，可以发现载体/HA和18-聚体/HA组中与骨 关节炎相关的形态改变（包括软骨变小、软骨表面纤维化以及软骨下骨崩坏），这些变化在 承受体重的部位尤其明显。相较于载体/HA组和18-聚体/HA组，在来自20-聚体/HA组 的样品中，软骨表面平滑，且软骨和软骨下骨相对较为完整。其它PEDF肽诸如29-聚体与 24-聚体亦可产生和20-聚体类似的效果（数据未示出）。这些结果显示本发明PEDF肽可 以消除与骨关节炎相关的病理学改变。
[0103] 正常软骨是有组织的层状结构，根据功能和结构可将其分成表层区（superficial zone)、中层或过渡区（middleortransitionalzone)以及径向 / 深层区（radial/deep zone)。表层区是提供平滑滑动面的关节表面；本区约占关节软骨厚度的10%至20%。表 层区中的软骨细胞多成狭长纺锤状，此区的胶原蛋白纤维的排列非常规则，且与关节面平 行。中层区占关节软骨体积的40%至60%。此区中胶原蛋白纤维排列较不规则，且此层中 的软骨细胞外型较圆（相较于表层中的软骨细胞）。深层区占软骨的30%，由直径较大的 胶原蛋白纤维所组成，其排列方向与关节表面垂直。软骨细胞通常成柱状，且和胶原蛋白纤 维的方向平行并垂直于关节线。图2提供了阐述该层状结构的代表性显微照片，所示照片 系取自MIA注射后25天的膝关节样品。
[0104] 由图2的照片可以看出，正常软骨中的细胞数目较低（hypocellular);而经过载 体/HA处理的膝盖中，可以观察到表层区中的软骨细胞大量流失，且在中层区与深层区中， 可以看到有分散的细胞集落（如箭头所指处）。相较之下，29-聚体/HA与20-聚体/HA处 理导致大量新生软骨细胞占据整个软骨。此外，在经过本发明PEDF肽处理的膝盖中，每一 层中的