CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCCCAAACCAAATCTATACCAATAAC〇
[0051] 3. DNA提取及DNA样本质检
[0052] ⑴DNA提取
[0053] 采用武汉昌美生物技术有限公司"唾液DNA提取纯化试剂盒（一管法）"提取（产 品货号：QT_275)。
[0054] (2) DNA 质检
[0055] 通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及是否降解；通过NAN0DR0P检测DNA浓度及纯 度。
[0056] (3) NaHSO3处理待测 DNA 样本。
[0057] (4) PCR 反应
[0058] 反应体系：
[0059]
[0061] 反应条件：
[0062]
[0063] *根据引物Tm值情况调整。
[0064] (5) SAP酶消化反应
[0065] 反应体系：
[0066]
[0067] 反应条件：
[0068]
[0069] (6)转录和酶切反应
[0070] 反应体系：
[0071]
[0072]
[0073] 反应条件：37°C温育3小时
[0074] (7)树脂纯化
[0075] 将反应产物的384孔板中加入20 μ 1三蒸水，在离心机中离心2000转/分钟离心 3分钟，加入树脂，在反转摇匀仪上做树脂纯化反应15min，脱盐；反应完成后在离心机中离 心2000转/分钟，离心3分钟；
[0076] 将脱盐处理后的样本点在样品靶上，自然结晶。
[0077] (8)质谱检测，收集数据
[0078] MALDI-T0F-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）反应；
[0079] Epityper软件检测质谱峰，根据质谱峰图判断甲基化程度。
[0080] 三、结果分析
[0081] 1.甲基化位点之间的关联性
[0082] 检测区段中包含七个甲基化CpG位点，但是位点CpGl的甲基化不能被检测到，因 此只能分析CpG2~CpG7这六个位点的甲基化情况。
[0083] 表1为所有受试者检测的甲基化位点之间的关联性。从表1可以看出，各个甲基 化位点之间相关程度不一，单一位点都具有统计显著性。
[0084] 表1所有受试者检测的甲基化位点之间的关联性
[0085]
[0086] 注：1、所有数值的P值均小于0· 05。
[0087] 2、甲基化位点CpGl检测不到甲基化，因此该表以及后续图表中均无该位点的数 据信息。
[0088] 图1~图6分别为每个受试者CpG2, CpG3, CpG4, CpG5, CpG6, CpG7的DNA甲基化值 及对应PM2. 5值的相关性。图7为所有受试者所有甲基化位点平均值以及对应PM2. 5值的 相关性。从图1到图7可看到除CpG3外，所有受试者的各个检测的甲基化位点以及它们的 均值都与PM2. 5有显著的相关性。值得注意的是，CpG4和CpG6两个位点的检测所得数值 一模一样，因此这两个位点所得到的结果是一样的。
[0089] 2.瞬时相关性分析
[0090] 分析各个甲基化位点当天甲基化值与PM2. 5的相关性，结果如表2所示。
[0091] 表2各个受试者的各个甲基化位点当天甲基化值与当天PM2. 5值的相关性P值
[0092]
[0093] 从上表中可以看到，各个受试者的甲基化位点当天甲基化值与当天PM2. 5值的相 关性并不大，因此，我们接下来探索PM2. 5累积效应与各个甲基化位点甲基程度的关系。
[0094] 3.同步时间段PM2. 5累积效应与各个甲基化位点甲基程度的关系
[0095] 图8为PM2. 5累积效应对DNA甲基化的影响示意图。其中，甲基化和PM2. 5累积 效应跨越的时间同步，横轴为跨越的天数；虚线代表的P值为0. 05。从图8可以看到：各个 甲基化位点的甲基化程度与PM2. 5的相关性为一条单峰曲线，7到11天这段时间的甲基化 与PM2. 5有显著相关性，而在9天这个时间段两者的相关性最强，即在9天这个时间段的甲 基化平均值与这9天的PM2. 5累积效应关联性最强。
[0096] 4.差异时间段甲基化与PM2. 5累积效应的相关性
[0097] 考虑到连续监测9天的甲基化程度的操作复杂性以及成本，本发明将甲基化跨 越的时间与PM2. 5累积效应跨越的时间不同步，缩短甲基化检测的时间段，分析缩短时间 后的甲基化程度与PM2. 5累积效应的相关性。
[0098] 图9~图11分别为监测3天、2天、当天甲基化与前一段时间PM2. 5累积效应的相 关性示意图。从图9到图11可以看到，缩短甲基化的检测时间会造成甲基化与PM2. 5累积 效应相关性减弱，但是无论如何缩短甲基化监测时间，总体上依然与前9天的PM2. 5累积效 应有显著相关性。
[0099] 5. PM2. 5变化对甲基化程度变化的影响分析
[0100] 从上面的结果可以看到在9天这个时间段中甲基化程度与PM2. 5的相关性最强， 接下来定量分析PM2. 5对甲基化程度造成的影响，探索单位PM2. 5的变化导致DNA甲基化 的改变。我们以9天作为时间窗口单位在时间轴上进行滑动，每9天的PM2. 5均值会对应当 前时间段的DNA甲基化均值，然后计算这两个均值在整个时间维度上的相关性，结果如表3 所示。
[0101] 表3 9天时间跨度下PM2. 5变化与各个DNA甲基化程度变化的相关性
[0102]
[0103] 从上表可以看到，除了 CpG2位点的相关性P值略高，其他所有位点的甲基化变化 与PM2. 5的变化都是显著相关的。其中CpG5位点的P值最小，且代表相关程度的Rho值也 最尚。
[0104] 6.定量分析PM2. 5对甲基化程度造成的影响
[0105] 既然各个位点的甲基化程度与PM2. 5的变化是有关系的，但是由于个体差异，每 个个体对于外界环境影响的敏感程度不一样。因此本发明将一段时间内的某个位点的DNA 甲基化值均值的中值作为阈值，将样本划分为不敏感组和敏感组，然后计算这两组样本中 在真实的PM2. 5高暴露组中的比例（odds ratio)以及相应的置信区间，和该统计的P值， 结果如表4~表6所不。
[0106] 表4最近三天的DNA甲基化值的中值作为阈值对人群进行分类的结果
[0107]
[0108] 表5最近两天的DNA甲基化值的中值作为阈值对人群进行分类的结果
[0109]
[0110] 表6最近一天的DNA甲基化值的中值作为阈值对人群进行分类的结果
[0111]
[0112] 从上述3个表可以看到，用甲基化可对人群对PM2. 5的敏感性进行分类。连续检 测3天的情况下，CpG4、CpG5、CpG6、CpG7的分类效果都能达到2左右。而且可发现一个大 致的规律：随着DNA甲基化检测时间的延长，分类效果会越来越好。
[0113] 表4到表6展示的是以甲基化均值的中值作为分类阈值对人群进行分类的情况， 若改变敏感人群和不敏感人群的分类方式，低于甲基化值均值25%的作为低风险，高于甲 基化值均值75%的作为高风险，对人群进行分类的结果如下：
[0114] 表7最近三天的DNA甲基化值的25%和75%作为阈值对人群进行分类的结果
[0115]
[0116] 表8最近两天的DNA甲基化值的25%和75%作为阈值对人群进行分类的结果
[0117]
[0118] 表9最近一天的DNA甲基化值的25%和75%作为阈值对人群进行分类的结果
[0119]
[0120] 从表7到表9可以看出，改变分类阈值之后，对人群进行分类的效果变得更好。分 类的效果都能达到2以上，最优的情况为用CpG2最近两天的DNA甲基化值的25%和75% 作为阈值对人群进行分类，分类效果可达到3. 4以上。
[0121] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视 为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种检测空气中可吸入颗粒物对人体影响的试剂盒，其利用唾液作为检测对象，能 够检测唾液DNA中F2RL3基因的核苷酸区段的甲基化，所述F2RL3基因的序列如SEQIDNO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，所述核苷酸区段在F2RL3基因SEQIDNO:1中的位 置为1627~1832,具体序列如SEQIDNO:2所示。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，用于检测所述核苷酸区段在SEQIDNO:1的第1671、 1682、1723、1758、1773、1791和1802位的七个CpG位点中任一位点的甲基化。4. 根据权利要求1~3任一项所述的试剂盒，采用sequenom公司的飞行质谱方法检测 所述核苷酸区段的甲基化情况，并提供检测所用的引物对。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述引物对可以在严格条件下与SEQIDNO:2 的基因序列杂交。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述引物对的序列如SEQIDNO:3和SEQID NO:4所示。7. 可以在严格条件下与SEQIDNO:2的基因序列杂交的引物对用于制备检测空气中 可吸入颗粒物对人体影响的试剂盒的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其中所述引物对的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO: 4所示。
【专利摘要】本发明公开了一种检测唾液中F2RL3基因甲基化的引物和试剂盒及其使用方法，同时还公开了所述引物和试剂盒的应用。本发明通过PCR扩增结合质谱检测F2RL3基因甲基化，并对PM2.5与唾液中F2RL3基因甲基化之间的相关性进行评估。而且，本发明了一种评估空气中可吸入颗粒物(如PM2.5)对身体造成影响的评价方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104928370
【申请号】CN201510284750
【发明人】熊江辉, 梁峰吉, 周雄辉, 吴安东, 元艳宏, 乔文艳, 刘长宁, 王晨, 宁争志, 赵璐, 党平, 李莹辉
【申请人】深圳市太空科技南方研究院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月29日