AGTAAATTCGACGAC ；
PP64100-F:GAATTGAGTGCGTGTGTCATGAGT ；
PP64100-R:GTTCGATGGCATCACCAACAT ；
PP32087-F:GCACAGGTATTGTCATCAACTTGG ；
PP32087-R:GTCCATGTAACACTACCACCACCA ；
PP85099-F:TGAAAGACAGACCTCGGGATAGTC ；
PP85099-R:TTACTCCAGTGTGCTGTTCAAACC ；
PP80085-F:ACGACTACTACGACTACCACCGC ；
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PP56123-R:ATCTGATAACTTGAAACCCCAACG ；PP76127-F:TGTTTGAACGTGCTAGATCGAGAG ；
PP76127-R:CCCTTCCTGGACTTGCATTATTAC ；
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PP60130-F:CCTTCTTGCTCAGATTTTGGAGAA ；
PP60130-R:CCATCCTCATTATCTCGAGTCCC ；
PP93120-F:GGGACCAATGATGGAAATCAAATA ；
PP93120-R:TAAGGTCAATGAGATTGTTTCGCA ；
PP23157-F:AATGATCATGACCACGACGATG。
[0007]PP23157-R:ACACTAATAGGAGTCGTCGTTCGCPP45160-F:GTTACATCCTCTGGACTGGCATCTPP45160-R:ATATCAGCTGTAAGGAGTGGCGTTPP30156-F:TTAGCACATATTGCATAGGCATGGPP30156-R:GAAGCACAATCCCGAAATAGATTGPP48147-F:ATCATCATCATCATTCACAATGGGPP48147-R:CATGAACAATGGTGACAACAACAA
本发明的有益效果在于:暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记，建立技术体系，弥补其特异性分子标记的空白，为暗褐网柄牛肝菌遗传多样性，群体遗传学及种质鉴定研宄提供有力的研宄工具。
【附图说明】
[0008]附图1是基于15个SSR分子标记构建的西双版纳暗褐网柄牛肝菌遗传距离UPGMA树。
【具体实施方式】
[0009]实施例1:
1、暗褐网柄牛肝菌全基因组SSR扫描及引物设计
将暗褐网柄牛肝菌PP33菌株基因组从头测序，拼装得到的scaffold文件作为输入文件，利用MISA进行全基因组SSR扫描，运用primer3，以被检测到的SSR上下游100 bp侧翼序列进行引物设计。引物设计的条件如下:最适长度24 bp;最短长度20 bp;最长长度28 bp ;最适退火温度63°C ;最低退火温度60°C ;最高退火温度65°C ;—对引物退火温度差的最大值为1°C。
[0010]2、暗褐网柄牛肝菌基因组DNA的提取和检测
取暗褐网柄牛肝菌干燥标本(约0.05克)，置于1.5ml的离心管中，采用改进过的CTAB法提取基因组DNA (Xu et al.1994): (I)向上述加入标本的离心管中加入少许石英砂，再加入250 μ L的2 X CTAB裂解液，用研磨棒进行充分研磨，直至呈匀浆状，再加入600 μ L的2XCTAB裂解液，颠倒混匀。(2)将装有研磨充分标本液的离心管置于65°C水浴I小时(其间每10分钟翻转离心管I次)。(3)加入苯酚和氯仿各300 μ L，翻转离心管几次，13000 rpm离心10分钟。(4)收集上层水相，转至新的1.5mL离心管中。(5)重复(3) - (4)步2至3次，直至两相界面上无沉淀为止。(6)加入等体积的氯仿抽提一次，收集上层水相。(7)加入0.5 -1倍体积预冷的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)，4°C下13000rpm离心10分钟。(8)小心倒去上清液，将离心管扣压在干净的面巾纸上，吸干残留的上清液。(9)加入ImL预冷的75%乙醇，翻转离心管几次，13000rpm离心10分钟，弃除上清液，重复两次。(10)置于室温或真空系统中干燥。(11)加入50 μ L无菌水室温溶解，于-20°c保存备用。
[0011]电泳检测基因组DNA的提取情况:将提取的DNA样品与1XLoading Buffer (已加溴酚蓝)按10:1混合上样于1%的琼脂糖凝胶，于150V电压下电泳10分钟，并于紫外灯下检测。
[0012]3、SSR片段的PCR扩增反应
在上述全基因组SSR扫描及引物设计的结果中，随机从不同scaffold上挑选30对引物，并通过本地Blast检测这些引物在基因组中的专一性，合成引物时在正向引物加上不同的荧光标记。通过预实验后，选取多样性较好的15对引物对全部样品进行PCR扩增。
[0013]50 μ L 的 PCR 扩增反应体系为:50ng/ μ L 的模板 I μ L ；25mM 的 MgC12 5 μ L ；10mM的dNTPs I yL ;6 μΜ的前、后引物各I yL ;5U/yL的DNA Taq酶0.2 μ L ;10PCR反应缓冲液5 μ L ;去尚子水35.8 μ L。
[0014]PCR扩增反应使用降落PCR(Touchdown PCR)反应，反应程序为:95°C预变性5min，接下来94°C变性lmin，60 ~ 52°C退火I min，72°C延伸lmin，一共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增产物上样，用1.0%的琼脂糖凝胶、I X TBE电泳液中电泳检测，PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司进行基因分型。
[0015]4、基于SSR数据的遗传多样性分析
对来自西双版纳的68个暗褐网柄牛肝菌样品进行遗传多样性分析。将SSR 二元数据输入DPS软件，以Jicard方法进行遗传距离的计算，并将计算结果输入MEGA 5.2进行UPGMA树的构建。
[0016]在全部样品中15个SSR位点(具体同
【发明内容】
部分所述)的分型结果显示，每个位点的等位基因数目为2 ~ 7个，平均3.6个，期望杂合度的总平均值为0.397，观测杂合度的总平均值为0.552，多态性较高。
[0017]结果表明，如图1所示，全部样品在UPGMA树上都成独立的分支，15个位点中的多态性信息已经能够把68个样品都区分开，说明这些引物在检测群体中能够为提供足够的多样性，能够用于后续的遗传多样性、群体遗传学及种质鉴定研宄。
【主权项】
1.暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记，其特征在于暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记包括15个具有多态性的 SSR 分子标记，其编号为:PP50097、PP64100、PP32087、PP85099、PP80085、PP56123、PP76127、PP57130、PP39117、PP60130、PP93120、PP23157、PP45160、PP30156、PP48147 ;其中: 上述SSR分子标记的核苷酸序列分别为: PP50097，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成: PP64100，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成: PP32087，由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成: PP85099，由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成: PP80085，由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列组成: PP56123，由SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成: PP76127，由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成: PP57130，由SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成: PP39117，由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列组成: PP60130，由SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列组成: PP93120，由SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列组成: PP23157，由SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列组成: PP45160，由SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列组成: PP30156，由SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列组成: PP48147，由SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列组成: 上述SSR分子标记的引物序列分别为:PP50097-F:ATACGACCCTGTGTACTGCCATTC ；PP50097-R:AGTGCGATGAGTAAATTCGACGAC ；PP64100-F:GAATTGAGTGCGTGTGTCATGAGT ；PP64100-R:GTTCGATGGCATCACCAACAT ；PP32087-F:GCACAGGTATTGTCATCAACTTGG ；PP32087-R:GTCCATGTAACACTACCACCACCA ；PP85099-F:TGAAAGACAGACCTCGGGATAGTC ；PP85099-R:TTACTCCAGTGTGCTGTTCAAACC ；PP80085-F:ACGACTACTACGACTACCACCGC ；PP80085-R:TCATAGTCGTTATCGTTGTTCGTTG ；PP56123-F:GTACGTATGCACAAGTAAGCGACG ；PP56123-R:ATCTGATAACTTGAAACCCCAACG ；PP76127-F:TGTTTGAACGTGCTAGATCGAGAG ；PP76127-R:CCCTTCCTGGACTTGCATTATTAC ；PP57130-F:ATATGGCCACCTTGTATCACCATC ；PP57130-R:CTCAAGTGTGGGAGTTGCCTCTAT ；PP39117-F:AGTCTTTACGCGCTTGTTGGATAC ；PP39117-R:GGAGAGAAAATGGACTGACTTGGA ； 。VV3VV3VV3V0XSXVV3VV0XV3” H-ZHOC寸 dd ^ S0XVV3V3XXV3XV3XV3XV3X<干 ZH8 寸 dd ^ 3XXV0VXVVV0333XVV3V30VV9.H-sT—1codd ^ SXV3SVXV30XXVXV3V30VXX” 干 STOcodd ^ XXOCJSXOVSVVXOXCJOVOXVXV” H-02LO寸 dd ^ X3XV3SX3VSX3X33XV3VXX9.干 09TLO寸 dd ^ 303XX03X03X0VSVXVVX3V3<H-zLOTsdd -oxv§§33voxv3xvoxvv” ￡LOTsdd ^ V303XXX0XXV0V0XVV3XSVVX” H-0^co6dd ” VXVVV3XVVVSXV0XVV33VS9.干 0^co6dd ^ 333X0V03X3XVXXV3X33XV33” H-0coT09dd ^ VVOVOOXXXXVOVOXOOXXOXXOV.干 0coT09ddKs/S P ^ n Xl VCO9Z9寸6寸OI No
【专利摘要】本发明涉及暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记，属DNA分子标记技术领域。本发明在已经获得其基因组数据的基础之上，利用常规的生物信息学方法，在基因组水平上检测其SSR的分布，进行引物设计，利用来自西双版纳地区的暗褐网柄牛肝菌样品，选取部分引物进行初筛、复筛后，得到15个具有多态性的SSR分子标记，其编号为： PP50097、PP64100、PP32087、PP85099、PP80085、PP56123、PP76127、PP57130、PP39117、PP60130、PP93120、PP23157、PP45160、PP30156、PP48147。本发明的有益效果在于：暗褐网柄牛肝菌SSR分子标记，建立技术体系，弥补其特异性分子标记的空白，为暗褐网柄牛肝菌遗传多样性，群体遗传学及种质鉴定研究提供有力的研究工具。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946763
【申请号】CN201510338932
【发明人】曹旸, 徐建平, 张颖, 张春霞, 何明霞, 刘静, 高锋, 王文兵, 许欣景
【申请人】云南省热带作物科学研究所, 云南大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月18日