调整抑至8.0定容至1000ml，高压灭菌，室温保存；
[0163] 4HTCBE(购买自日本同仁化学研究所，货号M030)
[0164] 巧透析袋（截留分子量14000)炬ioshopInc)
[01化]制备步骤具体为：
[0166] 1)透析袋的处理；将透析袋放入500ml(根据烧杯体积可变换用量）体积的 5mmol/L邸TA+200mmol/LNaHC〇3溶液中，煮沸lOmin;倾弃邸TA/NaHC〇3液，用超纯水轻轻 漂洗，再用500ml5mmol/L邸TA煮沸lOmin;弃掉煮沸液，彻底用超纯水清洗，加入大量的 超纯水浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋，用大量的超纯水彻底冲洗其内 外表面；
[0167] 2)取 2.OmgITC邸溶于 2mlDMS0中；
[0168] 3)取4.OmgIgM溶于4. 0ml棚酸盐缓冲溶液中（0. 01MpH9. 0)中；
[0169]4)缓慢将步骤2制备的液体加入IgM溶液中，边滴加边震荡，于25°C，10化/min的 摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgM结合的ITCBE;
[0170] 5)将透析所得的液体用Imol/L肥1调节抑值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80y1 Immol/L铭离子溶液，边滴加边振荡，W免铭离子使蛋白变性沉淀；
[017U6)将加好的溶液在25°C，lOOr/min的摇床中反应化，用处理好的透析袋进行透析 2化；
[0172] 7)将透析后的液体于-20°C分装保存。
[017引 B)纯化铭-IgM馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液（即步骤A中 7)的透析后的液体）中未反应的IgM化及多余的铭离子，即得铭-IgM馨合物，具体步骤如 下：
[0174] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使铭-IgM馨合物 复溶；
[0175] (2)平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0176] 做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgM与 填料特异性结合；
[0177] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[017引 妨收集；收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0179] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0180] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铭特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0181] 做上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤做中样本，然后上柱；
[0182] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱；
[018引 （10)收集；收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0184] (11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铭-IgM馨合物；
[0化5] C)对铭-IgM馨合物的鉴定，具体步骤如下；
[0186] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0187] 似加样；取步骤B)中8化提取纯化得到的铭-IgM馨合物，加入2化上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0188] (3)电泳；连接电泳板，加入电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流， 环境温度为4度；至漠酪藍移至胶底部时停止电泳；
[0189] (4)检测；在胶床上找出含铭的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用AAS法检测是否含有铭W及检测铭的含量。
[0190] D)检测结果
[0191] (1)电泳结果：
[0192] 其中，图1为本发明所述的铭-IgM馨合物的非变性电泳条带图。
[0193] (2)同步福射X巧光分析；
[0194] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机任EPC)的4W1" 同步福射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动W改变入射光斑位置，移动步长为0. 0025mm。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器 (PGTInc.LS30143-D巧探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA4000)获取输出。用11.化eV的单色同步福射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均匀 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AXIL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，W抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下W同样的方式测量定量标准干胶 膜的巧光谱。
[0195]图2为本发明所述的铭-IgM馨合物的同步福射X线电泳条带的巧光分析图，图中 横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该蛋白条带中铭金属能量（含量）值。
[0196] (3)采用石墨炉原子吸收光谱法（AA巧初步测定本实施例得到的铭-IgG馨合物中 的铭含量，其含量为173. 242yg/L。
[0197] 本发巧一种定量檢测絡-IgM臀合物的方法的檢测条件的确定:
[019引 1.补体蛋白最佳工作浓度W及血浆的最佳稀释倍数的确定
[0199] 步骤如下；
[0200] (1)将抗IgMAb用稀释缓冲液按照W下质量体积比（稀释度）1:500、1:1000、 1:2000、1:4000进行稀释，加入化ISA板微孔中，将抗IgMAb包被于固相载体上，每个浓度 包被S排，4°C过夜18小时；
[0201] 似移去稀释缓冲液，并用洗漆液进行洗漆，待洗漆完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗漆液进行洗漆； 悦0引 （3)待检样品与稀释缓冲液按照W下质量体积比（稀释度）1:1〇、1:20、1:40进行 稀释，加入微孔中，按照上述包被的抗IgMAb浓度，同一个浓度的抗IgMAb的分别加入不 同稀释度血浆，37°C作用1小时；
[0203] (4)移去待检样品，并用洗漆液进行洗漆，待洗漆完成后，加入抗crAb，抗crAb 与稀释缓冲液按照W下质量体积比（稀释度）1:5000、1:10000、1:20000、1:40000进行稀 释，按照每一个相同抗IgMAb、血清稀释浓度，不同浓度抗crAb各加2孔，37°C作用1小 时，使抗crAb与IgM上的金属铭反应；
[0204] (5)酶标抗体选择最适工作浓度，即化g/ml，移去抗cr抗体，并用洗漆液进行洗 漆，待洗漆完成后，加入用稀释缓冲液稀释HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使HRP酶标抗体 与铭-IgM馨合物反应；
[02化](6)移去酶标抗体，并用洗漆液进行洗漆，待洗漆完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0206] (7)W与加底物液相同的速度和顺序滴加终止液至每一微孔；
[0207] (8)取波长405皿，加完终止液后，将化ISA板置于酶标仪上分别读取各孔OD值。 根据各孔OD值数值，选择抗IgMAb、抗cr-Ab的最佳工作浓度W及血浆的最佳稀释倍数。 [020引试验中同时W所制对照品作为阳性对照，选择IgM抗体+封闭+cr抗+酶标+底 物（即不加检测样本）作为阴性对照1、IgM抗体+封闭+血浆+酶标+底物（即不加cr 抗）作为阴性对照2、IgM抗体+封闭+酶标+底物（即不加检测样本和cr抗）作为阴性 对照3、IgM抗体+封闭+血浆+cr抗+底物（即不加酶标）作为阴性对照4,封闭+血浆 +cr抗+酶标+底物（即不加IgM抗体）作为空白对照1，只加底物及PBS作为空白对照2 ; 检测结果见表1-2。
[0209] 表1;抗IgMAb和cr抗体最佳工作浓度W及血浆稀释倍数的确定
[0210]
[0214] 由表1-2数据显示，我们可W看出当人IgM抗体的稀释度为1:500、全血稀释度为 1:20、cr抗稀释度为1:10000时，OD值最大，虽然OD值小于0. 8,但是其所对应的阴性对照 组OD值全部小于0.1，并且其所对应的阳性对照组，OD值大于0.8,所W选此值所对应的浓 度作为最佳工作浓度（即人IgM抗体浓度为1:500,全血稀释度为1:10,cr抗稀释浓度为 1:10000)。
[0215] 2.ELISA洗脱液最佳工作浓度及时间确定
[0216] 步骤如下；（1)将人IgM抗体用稀释缓冲液稀释至500倍（质量体积比），加入 ELISA板微孔中，37°C水浴3小时，储存冰箱；
[0217] 似移去稀释缓冲液，并用洗漆液进行洗漆，待洗漆完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗漆液进行洗漆；
[0218] (3)移去封闭液，并用洗漆液进行洗漆，待洗漆完成后，加入用稀释缓冲液稀释的 HRP酶标抗体，37°C作用2小时，使其与人IgM抗体反应；
[0219] (4)准备洗脱液；将木瓜蛋白酶用抑8.0,0.Imol/LTris-HCI缓冲液配制成 l-2mg/ml，再加入Immol/L二硫苏糖醇值TT)37°C解育30min;
[0220] (5)移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中的木瓜蛋白酶浓 度：酶标抗体浓度比=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5,其中，每个浓度作3个复孔，分别放置于 37°C温度下洗脱lh、2h、：3h;
[0221] (6)移去洗脱液，并用洗漆液进行洗漆，待洗漆完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0222] (7)W与加底物液相同的速度和顺序滴加终止液至每一微孔；
[0223] (8)取405皿波长，加完终止液后，将化ISA板置