；在屯、肌组织中表 达出现显著性差异（包括升高或者降低）的有74个miRNAs,而在外周血中表达出现显 著性差异（包括升高或者降低）的有599个miRNAs,有25个miRNAs在两种巧片中的 表达均发生改变，其中表达均升高的有6种（图2A) 〇isa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、 hsa-miR-665、hsa-miR-660-：3p、hsa-miR-206 和hsa-miR-1268b)，表达均下降的有 2 种（图 2B)化sa-miR-130a-化和hsa-miR-33〇-化），提不该8种miRNAs均可作为候选生物学标志 物用于慢性屯、力衰竭的诊断。由于循环miRNAs与组织miRNAs之间的表达分布受多种因 素影响，包括：组织生成、组织降解、组织摄取和组织分泌等，因此可能出现循环miRNAs和 组织miRNAs表达改变不一致的情况（Oncotarget. 2015Mar10.圧pub址eadofprint]， PMID:25860935)。并且由于慢性屯、力衰竭是由多种原因导致的全身多器官受累的疾病，其 他脏器功能也不同程度发生变化，循环miRNAs表达量不仅与屯、肌miRNAs表达量密切相关， 其他脏器功能也可能影响外周血miRNAs的表达（ClinChem. 2013Dec;59 (12) : 1742-52J HumHypedens. 2014May;28巧）：288-91)。因此只有该8种miRNAs是最可能和慢性屯、力 衰竭特异性相关的。
[0035] 实施例4.巧片结果Real-timePCR验证
[0036] 在第二个独立人群中，另外分别收集200例慢性屯、力衰竭患者和200例正常对照 人群外周血，按照上述方式提取RNA。
[0037] 采用广州锐博公司miRNA检测试剂盒对上述巧片初筛的在两种巧片中的表达均 发生改变的8种miRNAs的表达在第二个独立人群中进行real-time PCR检测；
[003引 miRNAs逆转录；
[0039] 逆转录引物（RTPrimerMix)配置；
[0040] miRNARTPrimer1y1
[0041]U6RTPrimer1y1
[0042] RNasefree&0 78y1
[0043] 逆转录反应体系；
[0044] RNAtemplate2yg
[0045]RTPrimerMix4y1
[0046] RNasefree&0upto19y1
[0047]W上体系混匀后，瞬时离心7〇°C解育lOmin后，冰育2min，再加入W下试剂：
[0048] 2XTSreactionbuffer25y1
[0049]TSenzyme2. 5y1
[0050]RNasefree&0 3. 5y1
[0化1] 逆转录反应程序：
[0化引 42°C60min，70°ClOmin;停止后4°C备用，产物保存于-20°c。
[005引miRNAsreal-timePCR;
[0054]反应体系；2XSYBRGreenMix9y1 [0化5]RTproduct2y1
[0056] miRNA化风3'(1Primer2y1
[0057] miRNAReversePrimer2y1
[0化引RNase-free&0 5y1
[0059] 反应程序：
[0060] 95°C30sec-巧5°ClOsec-60°C20sec-70°CIsec)X40cycles-Melting Curve
[0061] 结果显示；其中8种miRNAs,即miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-化、 miR-206、miR-1268b、miR-130a-化和miR-33〇-化表达的结果与巧片检测结果一致，两个慢 性屯、力衰竭患者人群的外周血中miRNAs变化趋势结果相同（图3)。表明8种miRNAs可作 为一类慢性屯、力衰竭诊断的候选生物标志物，realtimePCR检测方法结果可靠。
[0062] 实施例5.差异性表达miRNAs诊断慢性屯、力衰竭的灵敏度
[0063] 收集200例慢性屯、力衰竭患者（取自2007-2014年武汉市医院住院患者，每个病 例均由两个或W上临床医师确诊分类）和200例正常对照人群外周血。按照前述方法提取 RNA，并检测实施例4中筛选出的8种miRNAs的表达，并进行R0C分析。
[0064] 结果显示；患者外周血中miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-：3p、miR-206 和miR-1268b分别升高至对照组人群的约50倍、40倍、100倍、800倍、45倍和50倍，而 1111尺-1303-化和11111?-330-化分别下降至对照组人群的50%左右（图3)。且11111?-4491、 miR-1285-3p、miR-665、miR-660-化、miR-206 和miR-1268b对诊断慢性屯、力衰竭具有高灵 敏度（AUOO. 9)(图4A)，其中屯、肌高丰度的miR-1285-3p，miR-665和miR-660-化的表达 量与射血分数显著相关（P<〇. 05)(图4B)。
[0065] 目前，屯、脏射血分数是临床上最常用的用于评估屯、脏功能指标，屯、脏射血分数越 低提示患者预后越差。表明miR-1285-3p，miR-665和miR-660-化可作为一种诊断和评估 慢性屯、力衰竭预后的生物标志物。
[0066] 实施例6.制备检测慢性屯、力衰竭风险评估的试剂盒
[0067] 试剂盒成分；检测试剂盒包括用于扩增8种miRNAs(miR-4491、miR-1285-3p、 miR-665、miR-66〇-3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-化和miR-33〇-化）的特异性逆转 录引物及real-timePCR引物对各一套；用于扩增对照RNA扣6)的特异性逆转录引物及 real-timePCR引物对一套及相关试剂，成分和含量如下（100次），保存于-20度。所述 引物根据下列引物设计原则获得；1)基于茎凸环结构设计的的特异性逆转录引物与miRNA 3'端序列结合，在逆转录酶作用下进行针对特定miRNA的特异性逆转录反应；2)基于逆转 录引物序列设计的特异性正向PCR引物、通用反向引物。
[0068]
[0069]
[0070] W上试剂均由各来源公司提供，已经商品化。具体检测方法及相关反应参数参照 实施例1。
[0071] 序列表；
[0072] miR-4491、miR-1285-3p、miR-665、miR-660-：3p、miR-206、miR-1268b、miR-130a-3p 和miR-330-化
[0073] hsa-miR-4491 核酸序列；
[0074] SequenceIDNo. 1:5'AAUGUGGACUGGUGUGACCAAA3'
[0075] hsa-miR-1285-化核酸序列；
[0076] SequenceIDNo. 2:5'UCUGGGCAACAAAGUGAGACCU3'
[0077] hsa-miR-665 核酸序列；
[0078] SequenceIDNo. 3:5-ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU3-
[0079] hsa-miR-660-化核酸序列；
[0080] SequenceIDNo. 4:5'ACCUCCUGUGUGCAUGGAUUA3'
[OOW] hsa-miR-206 核酸序列；
[0082] SequenceIDNo. 5:5'UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG3'
[008引hsa-miR-1268b核酸序列；
[0084] SequenceIDNo. 65'CGGGCGUGGUGGUGGGGGUG3'
[0085] hsa-miR-130a-化核酸序列；
[0086] SequenceIDNo. 7:5'CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU3'
[0087] hsa-miR-330-化核酸序列；
[0088] SequenceIDNo. 8:5-GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA3-。
【主权项】
1. 一种诊断慢性心力衰竭或评估慢性心力衰竭预后的外周血miRNAs生物标志 物，其特征在于，所述生物标志物包括hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、 hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p 和 / 或 hsa_miR-33〇-3p， 其序列结构分别如SEQ ID No. 1-8所示。2. 如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括 hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665 和 / 或 hsa-miR-660-3p，其序列结构分别如 SEQ ID No. 2、 3和4所示。3. -种用于检测下列miRNAs序列的试剂，其特征在于，所述序列包括SEQ ID No. 1，2， 3,4,5,6,7 和 / 或 8。4. 如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂为所述miRNAs序列的逆转录引物 和扩增引物。5. 如权利要求3或4所述的试剂，其特征在于，所述miRNAs序列为SEQ ID No. 2、3和 /或4。6. 权利要求3-5任一所述的试剂在制备诊断或者评估慢性心力衰竭患者预后的试剂 盒中的用途。7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的慢性心力衰竭包括先天性心脏病、冠 心病、急性心肌梗死、风心病、高血压、心律失常、各种病因导致的心肌炎、心肌病等病因导 致的慢性心力衰竭。8. -种诊断或者评估慢性心力衰竭患者预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 权利要求3-5任一所述的试剂。9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的慢性心力衰竭包括先天性心脏病、 冠心病、急性心肌梗死、风心病、高血压、心律失常、各种病因导致的心肌炎、心肌病等病因 导致的慢性心力衰竭。10. -种检测权利要求1所述的miRNAs生物标志物的方法，其特征在于，用权利要求 3-5任一的试剂对所述miRNAs生物标志物进行检测。
【专利摘要】慢性心力衰竭相关的血清miRNA及其应用。本发明提供一类外周血miRNAs在慢性心力衰竭的作为生物标志物风险评估/诊断和预后中的用途。其中，hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p和hsa-miR-330-3p在慢性心力衰竭患者外周血中差异性表达；证明外周血hsa-miR-665等能特异性诊断慢性心力衰竭，并且其表达水平与射血分数呈相关性，具有评估预后的作用。从而，通过检测上述miRNAs的表达水平可用来预测和协助诊断已经存在的慢性心力衰竭或评估慢性心力衰竭的预后。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113
【公开号】CN104988216
【申请号】CN201510308334
【发明人】汪道文, 陈琛, 李华萍
【申请人】汪道文, 陈琛, 李华萍
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月8日