基因产物即PitA蛋白质的活性。
[0213] 大肠杆菌K12MG1655菌株的pitA基因相当于在NCBI数据库中注册为GenBank 登录号NC_000913(VERSI0NNC_000913. 2GI:49175990)的基因组序列中的 3635665 ~ 3637164位的序列。大肠杆菌K12MG1655菌株的pitA基因与ECK3478、JW3460含义相同。 另外，大肠杆菌K12MG1655菌株的PitA蛋白质注册为GenBank登录号NP_417950(version NP_417950. 1GI: 16131365、locus_tag= 〃b3493〃）。将MG1655 菌株的pitA基因的碱基序 列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1及2。
[0214] 菠萝泛菌LMG20103菌株的pitA基因相当于在NCBI数据库中注册为GenBank 登录号NC_013956(VERSI0NNC_013956.2GI:332139403)的基因组序列中的 1397898 ~ 1399514位的序列的互补序列。另外，菠萝泛菌LMG20103菌株的PitA蛋白质注册为 GenBank登录号YP_003519531(versionYP_003519531. 1GI: 291616789、locus_tag= 〃PANA_1236〃）。将菠萝泛菌LMG20103菌株的pitA基因的碱基序列及相同基因编码的PitA 蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号3及4。
[0215] 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因相当于在NCBI数据库中注册为GenBank 登录号NC_003450(VERSIONNC_003450. 3GI:58036263)的基因组序列中的 481391 ~ 482776位的序列的互补序列。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因与Cgl0460 含义相同。另外，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的PitA蛋白质注册为GenBan登录号 NP_599707(versionNP_599707. 1GI: 19551705、locus_tag= 〃NCgl0445〃）。将谷氨酸棒 状杆菌ATCC13032的pitA基因的碱基序列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分 别示于序列号25及26。另外，将谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的pitA基因的碱基序 列及相同基因编码的PitA蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号5及6。
[0216] 磷酸盐转运蛋白只要具有磷酸盐转运蛋白活性，则可以为上述磷酸盐转运蛋白， 例如各种PitA蛋白质的变体。需要说明的是，有时将这样的变体称为"保守变体"。作为 保守变体，例如可以举出上述磷酸盐转运蛋白，例如各种PitA蛋白质的同源物及人工修饰 体。
[0217] 编码上述PitA蛋白质的同源的基因例如可以通过将上述pitA基因的碱基序列 (序列号1、3、5或25)用作查询序列的BLAST检索及FASTA检索从公开数据库中容易地获 得。另外，编码上述PitA蛋白质的同源物的基因例如可以通过以细菌或酵母的染色体为模 板，将基于这些公知的基因序列制作的寡核苷酸用作引物的PCR来获得。
[0218] 编码磷酸盐转运蛋白的保守变体的基因例如可以为如下所述的基因。S卩，磷酸盐 转运蛋白基因只要编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质，则可以为编码在上述氨基酸序 列中具有在1个或者多个位置取代、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋 白质的基因。此时，磷酸盐转运蛋白活性相对于取代、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸 之前的蛋白质，通常可维持70%以上，优选80%以上，更优选90%以上。需要说明的是，上 述"1个或多个"也根据氨基酸残基的蛋白质的立体结构中的位置及氨基酸残基的种类而不 同，但具体而言是指优选1~20个，更优选1~10个，进一步优选1~5个，特别优选1~ 3个。
[0219] 上述的1个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加为正常地维持蛋白质的功 能的保守突变。保守突变的代表性的突变为保守取代。所谓保守取代，在取代部位为芳香 族氨基酸的情况下，为在Phe、Trp、Tyr间互相取代的突变，在取代部位为疏水性氨基酸的 情况下，为在Leu、Ile、Val间互相取代的突变，在为极性氨基酸的情况下，为在Gln、Asn间 互相取代的突变，在为碱性氨基酸的情况下，为在Lys、Arg、His间互相取代的突变，在为酸 性氨基酸的情况下，为在Asp、Glu间互相取代的突变，在为具有羟基的氨基酸的情况下，为 在Ser、Thr间互相取代的突变。作为被视为保守取代的取代，具体而言，可以举出：从Ala 向Ser或Thr的取代、从Arg向Gln、His或Lys的取代、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp 的取代、从Asp向Asn、Glu或Gin的取代、从Cys向Ser或Ala的取代、从Gin向Asn、Glu、 Lys、His、Asp或Arg的取代、从Glu向Gly、Asn、Gin、Lys或Asp的取代、从Gly向Pro的 取代、从His向Asn、Lys、Gin、Arg或Tyr的取代、从lie向Leu、Met、Val或Phe的取代、从 Leu向lie、Met、Val或Phe的取代、从Lys向Asn、Glu、Gin、His或Arg的取代、从Met向 lie、Leu、Val或Phe的取代、从Phe向Trp、Tyr、Met、lie或Leu的取代、从Ser向Thr或 Ala的取代、从Thr向Ser或Ala的取代、从Trp向Phe或Tyr的取代、从Tyr向His、Phe 或Trp的取代及从Val向Met、lie或Leu的取代。另外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、 插入、添加或倒位等中也包含因基于基因来源的生物的个体差、种类的不同的情况等天然 产生的突变（突变体或突变体）而产生的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等。
[0220] 进而，具有如上所述的保守突变的基因可以为编码相对于上述氨基酸序列整体 具有80 %以上、优选90 %以上、更优选95%以上、进一步优选97 %以上、特别优选99 % 以上的同源性，且具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质的基因。另外，在本说明书中，"同源 性"（homology)是指"同一性"（identity)。
[0221] 另外，磷酸盐转运蛋白基因可以为在严格的条件下与可由公知的基因序列制备的 探针，例如相对于上述碱基序列的整体或一部分的互补序列杂交的DNA且该DNA编码具有 磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质。所谓"严格的条件"是指可形成所谓的特异性杂交且未形 成非特异性杂交的条件。若示出一个例子，则可以举出：同源性较高的DNA彼此，例如具有 80%以上、优选90 %以上、更优选95 %以上、更优选97 %以上、特别优选99%以上的同源 性的DNA彼此杂交，同源性比其低的DNA彼此不杂交的条件、或者通常的Southern杂交的 清洗的条件即在相当于60°(：、1\55(：、0.1%505、优选60°(：、0.1\55(：、0.1%505、更优选 68°C、0. 1XSSC、0. 1%SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2~3次的条件。
[0222] 如上所述，用于上述杂交的探针可以为基因的互补序列的一部分。如上所述的探 针可以通过以基于公知的基因序列制作的寡核苷酸为引物，以含有这些碱基序列的DNA片 段为模板的PCR来制作。例如，可以使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针。特别地， 在使用300bp左右的长度的DNA片段作为探针的情况下，作为杂交的清洗的条件，可以举出 50°C、2XSSC、0. 1%SDS。
[0223] 另外，磷酸盐转运蛋白基因只要编码具有磷酸盐转运蛋白活性的蛋白质，则可以 为任意的密码子取代为与其等价的密码子的基因。例如磷酸盐转运蛋白基因可以为以根据 使用的宿主的密码子使用频度具有最佳的密码子的方式进行修饰而成的基因。
[0224] 可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列同一性的百分比。此类数 学算法的非限制性例子包括Myers和Miller(1988)CABI0S4:11-17的算法、Smith等 (1981)Adv.Appl.Math. 2:482 的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol. Biol. 48:443-453 的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad. Sci. 85:2444-2448 的用于搜索同源性的方法、和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl. Acad.Sci.USA87:2264 的算法的修改形式，诸如记载于Karlin和Altschul(1993)Proc. Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877 的算法。
[0225] 通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较 (即比对）。程序可以由计算机适当执行。此类程序的例子包括但不限于PC/Gene程序（可 购自Intelligenetics,MountainView,Calif.)的CLUSTAL、ALIGN程序（Version2.0)、 和Wisconsin遗传学软件包，第8版（可购自GeneticsComputerGroup(GCG)，575Science Drive,Madison,Wis.，USA)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA。可以例如通过使 用初始参数实施使用这些程序的比对。CLUSTAL程序充分记载于Higginsetal. (1988) Gene73:237-244(1988)，Higginsetal. (1989)CABI0S5:151-153,Corpetetal. (1988) NucleicAcidsRes. 16:10881-90,Huangetal. (1992)CABI0S8:155-65 及Pearsonet al. (1994)Meth.Mol.Biol. 24:307-331。
[0226] 为了获得与靶核苷酸序列同源的核苷酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得 分100和字长度12的BLASTN程序实施BLAST核苷酸搜索。为了获得与靶蛋白同源的氨基 酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分50和字长度3的BLASTX程序实施BLAST蛋 白质搜索。关于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索，参见http://www.ncbi.nlm.nih. gov。另外，为了比较目的，可以使用缺口BLAST(BLAST2. 0)以获得包含缺口的比对。另 外，可以使用PSI-BLAST以实施用于检测序列间的远离关系的重复搜索。关于缺口BLAST和PSI-BLAST，参见Altschuletal. (1997)NucleicAcidsRes. 25:3389。在使用BLAST、 缺口BLAST、或PSI-BLAST时，可以使用每种程序（例如对于核苷酸序列为BLASTN，并且对 于氨基酸序列为BLASTX)的初始参数。也可以手动实施比对。
[0227] 两种序列间的序列同一性以在比对两种序列，使得彼此最大符合时两种序列中匹 配的残基的比率计算。
[0228] 需要说明的是，涉及上述的基因及蛋白质的变体的记载也可准用于L-氨基酸生 物合成体系酶等任意的蛋白质及编码它们的基因。
[0229] 〈1_3>使蛋白质的活性增大的方法
[0230] 以下，对增大蛋白质的活性的方法进行说明。
[0231 ] 所谓"蛋白质的活性增大"是指相同蛋白质的每个细胞的活性相对于野生株或亲 株等非修饰株增大。另外，也将"蛋白质的活性增大"称为"蛋白质的活性被增强"。所谓 "蛋白质的活性增大"，具体而言，是指与非修饰株相比，相同蛋白质的每个细胞的分子数增 加及/或相同蛋白质的每个分子功能增大。即，称为"蛋白质的活性增大"时的"活性"不仅 限于蛋白质的催化活性，也可以指编码蛋白质的基因的转录量（mRNA量）或翻译量（蛋白 质的量）。蛋白质的活性只要与非修饰株相比增大就没有特别限制，例如与非修饰株相比， 可以上升至1. 5倍以上、2倍以上或3倍以上。另外，所谓"蛋白质的活性增大"，不仅包含 在原本具有靶的蛋白质的活性的菌株中使相同蛋白质的活性增大，而且包含对原本不存在 靶的蛋白质的活性的菌株赋予相同蛋白质的活性。另外，结果，只要蛋白质的活性增大，则 使宿主原本具有的靶蛋白质的活性弱化及/或缺损，此外，也可以导入优选的相同蛋白质。
[0232] 蛋白质的活性增大这样的修饰例如可通过使编码相同蛋白质的基因的表达上升 来实现。另外，也将"基因的表达上升"称为"基因的表达被增强"。基因的表达例如与非修 饰株相比可以上升至1. 5倍以上、2倍以上或3倍以上。另外，所谓"基因的表达上升"不仅 包含在原本靶基因表达的菌株中使相同基因的表达量上升，而且包含在原本靶基因未表达 的菌株中使相同基因表达。即，所谓"基因的表达上升"例如包含在未保持靶基因的菌株中 导入相同基因使相同基因表达。
[0233] 基因的表达的上升例如可通过增加基因的拷贝数来实现。
[0234] 基因的拷贝数的增加可通过向宿主的染色体导入相同基因来实现。向染色体 的基因的导入例如可以利用同源重组进行（MillerI，J.H.ExperimentsinMolecular Genetics, 1972,ColdSpringHarborLaboratory)。基因可以仅导入 1 拷贝，也可以导 入2拷贝以上。例如可以通过以染色体上存在多个拷贝的序列为靶进行同源重组来向染 色体导入基因的多个拷贝。作为染色体上存在多个拷贝的序列，可以举出：反复DNA序列 (r印etitiveDNA)、存在于转座子的两端的反向重复序列。另外，也可以以L-氨基酸生 产所不需要的基因等的染色体上的适当的序列为靶进行同源重组。同源重组例如可以通 过Red驱动整合（Red-drivenintegration)法（Datsenko，K.A,andWanner，B.L.Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 97:6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用含有温度敏 感性复制起点的质粒的方法、使用可接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥作 用的复制起点的自杀载体的方法、或使用了噬菌体的转导法来进行。另外，基因也可以使用 转座子或Mini-Mu随机地导入到染色体上（日本特开平2-109985号公报、US5, 882, 888、 EP805867B1)〇
[0235] 在染色体上导入有靶基因的确认可通过使用了具有与相同基因的全部或一部分 互补的序列的探针的Southern杂交、或使用了基于相同基因的序列制作的引物的PCR等来 确认。
[0236] 另外，基因的拷贝数的增加也可通过将含有靶基因的载体导入到宿主中来实现。 例如可以通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主中发挥作用的载体连结而构建相同基因 的表达载体，在该表达载体中转化宿主来增加相同基因的拷贝数。含有靶基因的DNA片段 例如可通过以具有靶基因的微生物的基因组DNA为模板的PCR来获得。作为载体，可以使 用能够在宿主的细胞内自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。另外，为了选择转化体， 优选载体具有抗生素抗性基因等标记物。载体例如可以为源自细菌质粒的载体、源自酵母 质粒的载体、源自细菌噬菌体的载体、粘粒或噬菌粒等。作为可在棒状杆菌型细菌中自主复 制的载体，具体而言，例如可以举出：PHM1519 (Agric, Biol. Chem.，48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem.，48, 2901-2903 (1984));具有改良了这些载体的药剂抗性基因 的质粒；日本特开平3-210184号公报中记载的质粒pCRY30 ;日本特开平2-72876号公报 及美国专利5, 185, 262号说明书公报中记载的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、 PCRY3KE及pCRY3KX ;日本特开平1-191686号公报中记载的质粒pCRY2及pCRY3 ;日本特开 昭58-192900号公报中记载的pAJ655、pAJ611及pAJ1844 ;日本特开昭57-134500号公报 中记载的PCG1 ;日本特开昭58-35197号公报中记载的pCG2 ;日本特开昭57-183799号公报 中记载的PCG4及pCGll。
[0237] 在导入基因的情况下，基因只要可表达地保持在本发明的细菌中即可。具体而言， 基因只要以接受在本发明的细菌中发挥作用的启动子序列的控制而表达的方式导入即可。 启动子可以为源自宿主的启动子，也可以为源自异种的启动子。启动子可以为导入的基因 的固有的启动子，也可以为其它的基因的启动子。作为启动子，例如可以利用如后所述的更 强有力的启动子。
[0238] 另外，在导入2个或其以上的基因的情况下，各基因只要可表达地保持在本发明 的细菌中即可。例如各基因可以全部保持在单一的表达载体上，也可以全部保持在染色体 上。另外，各基因可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在单一或多个表达载体 上和染色体上。另外，可以采用2个或其以上的基因构成操纵子来导入。
[0239] 所导入的基因只要编码在宿主中发挥作用的蛋白质就没有特别限制。所导入的基 因可以为源自宿主的基因，也可以为源自异种的基因。
[0240] 另外，基因的表达的上升可通过提高基因的转录效率来实现。基因的转录效率的 提高例如可通过将染色体上的基因的启动子取代为更强有力的启动子来实现。所谓"更 强有力的启动子"是指基因的转录比原本存在的野生型的启动子提高的启动子。另外， 作为能够在棒状杆菌型细菌中利用的更强有力的启动子，可以举出：人工设计变更而成的 P54-6 启动子（Appl. Microbiol. Biotechnolo.，53, 674-679(2000))、能够在棒状杆菌型细 菌内用醋酸、乙醇、丙酮酸等衍生的pta、aceA、aceB、adh、amyE启动子、在棒状杆菌型细 菌内表达量多的强有力的启动子即cspB、SOD、tuf启动子（Journal of Biotechnology 104(2003)311-323，Appl Environ Microbiol.2005 Dec ;71(12):8587-96.)、 lac 启动 子、tac启动子、trc启动子。另外，作为更强有力的启动子，可以通过使用各种报告基因 来获得原有的启动子中的高活性的启动子。例如可以通过使启动子区域内的-35、-10区 域接近于共有序列来提高启动子的活性（国际公开第00/18935号）。启动子的强度的评 价法及强有力的启动子的例子记载在Goldstein等的论文（Prokaryoticpromotersin biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128 (1995))等中。
[0241] 另外，基因的表达的上升可通过提高基因的翻译效率来实现。基因的翻译效率的 提高例如可通过将染色体上的基因的夏因-达尔加诺（SD)序列（也称为核糖体结合部位 (RBS))取代为更强有力的SD序列来实现。所谓"更强有力的SD序列"是指mRNA的翻译比 原本存在的野生型的SD序列提高的SD序列。作为更强有力的SD序列，例如可以举出源自 噬菌体 17 的基因 10 的RBS(OlinsP. 0?et al, Gene,1988, 73, 227-235)。进而，已知RBS和 起始密码子之间的间隔区域、特别是起始密码子的近上游的序列（5'-UTR)中的多个核苷 酸的取代、或者插入、或者缺失对mRNA的稳定性及翻译效率造成非常大的影响，也可以通 过改变这些来提高基因的翻译效率。
[0242] 在本发明中，也将影响到启动子、SD序列及RBS和起始密码子之间的间隔区域 等基因的表达的部位统称为"表达调节区域"。表达调节区域可以使用启动子检索载体及 GENETYX等基因分析软件来确定。这些表达调节区域的修饰例如可以通过使用了温度敏感 性载体的方法及Red驱动整合法（W02005/010175)来进行。
[0243] 基因的翻译效率的提高例如也可通过改变密码子来实现。例如在进行基因的异 种表达等的情况下，可以通过将存在于基因中的稀有密码子取代为以更高频度利用的同义 密码子来提高基因的翻译效率。密码子的取代例如可以通过在DNA的目标部位导入目标 突变的部位特异性突变法来进行。另外，可以全合成取代了密码子的基因片段。各种生物 中的密码子的使用频度公开在"密码子使用数据库"（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura,Y.etal，Nucl.AcidsRes. ,28,292(2000))中。
[0244] 另外，基因的表达的上升也可通过扩增使基因的表达上升这样的调苄基因、或缺 失或弱化使基因的表达降低这样的调苄基因来实现。
[0245] 如上所述的使基因的表达上升的方法可以单独使用，也可以以任意的组合使用。
[0246] 另外，酶活性增大这样的改变例如也可通过增强酶的比活性来实现。比活性得到 增强