SEQ ID NO. 5所示，采用人工合成（苏州金唯智生物科技有限公司）。
[0034] 3、重组质粒的转化
[0035] 将测序正确的重组质粒pETDuet-His6-Sum〇-tha-3GSA-T4采用CaCl 2方法转化至 大肠杆菌宿主菌BL21 (DE3)中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株。
[0036] 4、Tha_T4融合蛋白的诱导表达及纯化
[0037] 挑取 pETDuet-His6-Sum〇-tha-3GSA-T4/BL21 单克隆至 50ml 培养基中，加入终浓 度为50ug/ml的氨苄青霉素，培养过夜。第二天转接至2L的LB培养基中，37 °C培养值0D6。。 为0. 8左右，加入终浓度0.1 mM的IPTG诱导，16°C培养18h。
[0038] 4°C、4000rpm 离心 30min，收集菌液，弃上清培养基，加入 30mL His bufferA (20mM Tris、200mM NaCl、10% glycerol、25mM Imidazole Final，PH 8.0)重悬菌体，高压机械破 碎菌体。4°C、16000rpm离心30min，重复2次，收集上清，将上清通过懦动栗输送至经过His bufferA预平衡过的Ni-NTA柱，使蛋白结合在柱子中。将柱子连接在FPLC中，用预设好的洗 脱程序洗脱（50%His buffer B(20mM Tris、200mM NaCl、10%glycerol、275mM Imidazole Final，PH 8.0))收集融合蛋白。分别收集总蛋白、破碎后上清与沉淀、过镍柱流穿及洗脱 下来的蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图1所示。
[0039] 在融合蛋白中以酶：融合蛋白为1:1000(体积比）的比例加入UIPl酶，以切除 sumo融合蛋白，再通过Ni-NTA柱子，流穿的为目的tha-3GSA-T4融合蛋白。浓缩目的蛋白 后通过FPLC将样品过凝胶层析柱superdex75,获得纯化后的目的tha-3GSA-T4融合蛋白， SDS-PAGE电泳如图2所示。采用冷冻干燥法将纯化后的目的蛋白冻成粉末保存，以便后续 的动物实验。
[0040] 实施例2 :抗菌肽Thanatin-T4溶菌酶（tha-3GSA-T4)融合蛋白的抗菌活性测定
[0041 ] 以牛津杯法检测融合蛋白的抗菌活性：
[0042] 在平板中先倒入一层琼脂粉，待其凝固后将对数生长期的试验菌分别按0. 1%的 接种量加入20ml50°C左右LB固体培养基中，混匀后再铺平板。在平板上垂直放上牛津杯， 并在其中加入200 μ L的样品，放入37 °C的烘箱12h。分别以Thanatin和T4溶菌酶单独为 对照。
[0043] 试验菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中革兰氏阳性菌选用枯草芽孢杆菌 (ATCC6633)，革兰氏阴性菌选用大肠杆菌（ATCC25922)。
[0044] 以抑菌圈的大小判断抑菌活性的强弱。
[0045] 结果如图3、图4所示，由抑菌圈大小可以看出：抗菌肽Thanatin-T4溶菌酶串联 蛋白的抑菌作用均大于Thanatin和T4的单独作用，并且要优于Thanatin和T4的混合溶 液。
[0046] 实施例3 :tha-3GSA_T4融合蛋白对仔猪成活率的研究
[0047] 实验用品种为杜洛克、大约克和长白母猪三元杂交种，在试验期间所有仔猪按正 常的免疫程序进行疫苗接种，并按常规方式进行管理。
[0048] 试验组：在饲料中按3%。（重量比，下同）的比例加入tha_T4融合蛋白。仔猪从7 日龄教槽开始添加直到保育舍出栏。
[0049] 对照组：仔猪按在饲料中3%。的比例分别加入Thanatin、T4溶菌酶、Thanatin+溶 菌酶（Thanatin和T4溶菌酶等摩尔比混合）、以及常规抗生素阿莫西林。
[0050] 结果如表1所示。
[0051] 表1仔猪哺乳、保育阶段存活率统计
[0052]
[0053] 由表1可以看出，tha_T4融合蛋白可显著提高哺乳及保育阶段仔猪成活率，并且 效果要好于Thanatin和溶菌酶单独和混合的作用，该效果很可能通过调节猪体免疫系统 而显著提高了仔猪健康状况。
[0054] 实施例4 :tha-3GSA-T4融合蛋白对保育猪生长性能的研究
[0055] 将200头杂种仔猪随机分成5组，每组2个重复，每个重复20头猪，公母各半。 各试验组依次在基础饲料中添加0. 5% (重量比，下同）阿莫西林组、0. 5% T4溶菌酶组、 0· 5 % Thanatin组、0· 5 % Thanatin+溶菌酶组（Thanatin和T4溶菌酶等摩尔比混合）、 0. 5% tha-T4融合蛋白组，并以基础饲粮组为空白对照组。分别记录仔猪的始重、末重、日 增重，结果如图5所示。分别记录仔猪的腹泻、呼吸道发病情况，结果如图6所示。
[0056] 由图5、图6可以看出，tha_T4融合蛋白组组生长性能均好于抗生素对照组、溶菌 酶组、Thanatin组、Thanatin+溶菌酶组，说明tha_T4融合蛋白能够通过提高猪群的健康水 平来间接促进仔猪生长增重。并且试验猪的腹泻率、呼吸道病发病率都有明显下降，说明使 用tha_T4融合蛋白制剂能明显降低保育猪的腹泻率以及呼吸道病发病率。
[0057] 本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程
技术领域的市售产品。
[0058] 以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应 属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都 应认为是包括在权利要求书的范围内。
[0059] 序列表：
[0060] SEQ ID NO. 1 ：
[0061] GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRMGSAGSAGSAMNIFEMLRIDEGLRLKIYKDTEGYYTIGIGHLLTKSPSL SVAKSELDKAIGRNCNGVITKDEAEKLFNQDVDAAVRGILRNAKLKPVYDSLDAVRRCALINMVFQMGETGVAGFTN SLRMLQQKRffDEAAVNLAKSRffYNQTPNRAKRVIATFRTGTffDAYKNL.
[0062] SEQ ID NO. 2 ：
[0063] GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM
[0064] SEQ ID NO. 3 ：
[0065] GSAGSAGSA
【主权项】
1. 一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，其特征在于：该蛋白从N端-C端依次包含了抗菌肽 thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，其特征在于：该蛋白是抗菌肽 thanatin蛋白编码基因、3GSA柔性肽编码基因、T4溶菌酶蛋白编码基因在基因水平融合后 在原核表达的可溶性重组蛋白。3. 权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的编码基因，其特征在于：其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 6所示。4. 权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 采用人工合成的方法获得依次包含抗菌肽thanatin基因序列、3GSA柔性肽基因序 列、T4溶菌酶基因序列的tha-3GSA-T4基因序列，如SEQ ID NO. 6所示； (2) 以pETDuet质粒为载体，构建pETDuet-Sum〇-tha-3GSA_T4重组质粒，并转化至大肠 杆菌ToplO中，通过鉴定、筛选，得到阳性克隆； (3) 将阳性克隆转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表 达菌株； (4) 挑取pEIDue-sum〇-tha-3GSA-T4/BL21单克隆至LB培养基，LB培养基中含50ug/ ml氨苄青霉素，37°C培养至OD 6。。为0. 75-0. 85,加入终浓度0.1 mM的IPTG进行蛋白诱导， 诱导条件为16°C培养16-20h，得到在上清表达的Sum〇-tha-3GSA-T4融合蛋白； (5) 对得到的Sum〇-tha-3GSA-T4融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗菌 肽-溶菌酶融合蛋白。5. 权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白在制备提高仔猪成活率的药物中的应 用。6. 权利要求1所述的抗菌肽_溶菌酶融合蛋白在制备降低保育猪腹泻率的药物中的应 用。7. 权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白制备降低保育猪呼吸道病发病率的药物 中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，该蛋白从N端-C端依次包含抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白。制备方法如下：采用人工合成获得包含抗菌肽thanatin、3GSA柔性肽、T4溶菌酶编码基因序列；以pETDuet质粒为载体，构建重组质粒；转化至BL21中，筛选获得表达菌株；挑取单克隆至LB培养基，进行蛋白诱导，得到在上清表达的融合蛋白；融合蛋白纯化，切除Sumo标签，得到目的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白。该蛋白被证明在提高仔猪成活率、降低保育猪的腹泻率、降低保育猪的呼吸道病发病率方面具有显著效果，可用于制备相关药物制剂。
【IPC分类】A61P11/00, C12N15/70, C07K19/00, A61P31/04, C12N15/62, A61P1/12, A61K38/47, C12N9/36
【公开号】CN105061603
【申请号】CN201510486586
【发明人】舒建洪, 王伟东, 吕正兵, 姜卫亮, 徐华强
【申请人】浙江益肽生物科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月11日